甜菜BvM14-MADSbox基因啟動子的克隆及瞬時表達分析.pdf

1、甜菜M14品系是通過二倍體栽培甜菜和野生白花甜菜進行種間雜交及回交，在其后代中篩選出的附加了白花甜菜9號染色體的單體附加系，附加的染色體平均傳遞率為96.5％。M14品系具有兼性無融合生殖的特性，是克隆無融合生殖相關基因極其難得的實驗材料。本實驗室前期通過抑制消減雜交技術(SSH)和RACE技術得到了甜菜M14特異表達基因BvM14—MADSbox的cDNA全長。通過生物信息學分析以及該基因在轉基因煙草中的組成型表達已初步證實BvM14

2、—MADSbox基因屬于MADS—box基因家族，在植物花各輪器官的分化發(fā)育及調控花期中起作用。由于MADS—box基因在植物體生長發(fā)育過程中起到重要的調控作用，而且它在植物體不同的發(fā)育階段有不同的時空表達模式，如果利用轉基因研究中載體常用的組成型啟動子35S驅動BvM14—MADSbox基因在植物各組織中恒定持續(xù)的表達，不能從時間和空間上進行有效調控，會存在一些缺陷。因此，為進一步深入研究BvM14—MADSbox基因的功能以期揭示該

3、基因的表達特性，克隆出其啟動子具有十分重要的意義，它可為今后分析BvM14—MADSbox基因表達調控機制以及利用BvM14—MADSbox自身特有的啟動子調控該基因在轉基因植物中表達，從而突破外源基因組成型表達的局限奠定基礎。 本研究利用染色體步移的方法從甜菜M14品系基因組DNA中克隆到BvM14—MADSbox基因起始密碼子上游1870bp的序列。通過在線分析軟件http：//www．fruitfly．org/seq_to

4、ols/promoter．html對該序列分析，預測出轉錄起始位點為A，位于起始密碼子上游152bp處。通過Plant CARE http：//bioinformatics．psb。ugent．bet/webtools/plantcare/html/在線分析，BvM14—MADSbox啟動子中含有的順式作用元件，結果表明該序列中除了包括TATA—box、CAAT—box等典型的真核生物順式調控元件外，還含有ARE、ABRE、ERE等重要

5、的順式調控元件和一些光反應相關的元件以及抗寒抗旱誘導元件。進一步通過PCR的方法擴增了4個BvM14—MADSbox啟動子5’缺失片段，分別命名為p1700、p1200、p700和p300。將4個缺失片段分別替換植物表達載體pBI121上的35S啟動子，構建了4個以GUS為報告基因的缺失表達載體，分別為pBI-P1700，pBI-P1200，pBI-P700和pBI-P300。利用農桿菌介導的葉盤法將4個缺失表達載體轉化煙草葉片。GUS