流式細胞分析

1、1,流式細胞術,胡嘉波江蘇大學基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院,2,,流式細胞儀（Flow Cytometer 簡稱FCM）是一項集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、計算機技術及細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的新型高科技儀器。概括來說，流式細胞術就是對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的技術。從開始設想到第一臺儀器的問世,科技工作者進行了不懈的努力。隨著各相關技術的迅速發(fā)展

2、，F(xiàn)CM技術已經成為日益完善的細胞分析和分選的工具。,3,,FCM儀器分為二大類：一類為臺式機，其特點為：儀器的光路調節(jié)系統(tǒng)固定，自動化程度高，操作簡便，易學易掌握。BD公司的臨床型 FACScan也是最早可用于臨床診斷的儀器。另一類為大型機，其特點為可快速將所感興趣的細胞分選出來，并且可將單個或指定個數(shù)的細胞分選到特定的培養(yǎng)孔或板上，同時可選配多種波長和類型的激光器，適用于更廣泛更靈活的科學研究應用。,4,●流式細胞儀實

3、物,BD FACSVantage,BD-Calibur,5,,其特點是：①測量速度快，最快可在1秒種內計測數(shù)萬個細胞；②可進行多參數(shù)測量，可以對同一個細胞做有關物理、化學特性的多參數(shù)測量，并具有明顯的統(tǒng)計學意義；③是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術、計算機技術、流體力學、細胞化學、圖像技術等從多領域的知識和成果；④既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。,6,,概要說來，流式細胞術主要包括了樣品的液流技術、細胞的分選和計數(shù)

4、技術，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術等。FCM目前發(fā)展的水平凝聚了半個世紀以來人們在這方面的心血和成果。,7,流式細胞儀發(fā)展的歷史,起源: 1934年--- 細胞計數(shù)儀 雛形: 1949年--- Coulter 計數(shù)器 1959年--- B型Coulter計數(shù)器 1972年: BD(Becton-Dickinson) 第一臺流式細胞儀, 具有分選功能,8,流式細胞儀主要由三部分

5、組成：流動室和液流系統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下： 液流系統(tǒng)：依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)。 光路系統(tǒng)：細胞由激光激發(fā)，通過光學濾片產生光信號，并傳送到相應的探測器。 電系統(tǒng)：把光信號轉換為電信號。,,9,在流式細胞儀中，細胞被傳送到液流中的激光照射區(qū)。任何存在于懸液中的直徑為0.2-150微米的粒子或細胞都適用于流式分析。在實際工作中，用實體組織進行流式細胞分析往往是不可能的，分析之前必須對其進行分解。被液滴包繞的

6、粒子稱為細胞液柱，當粒子經過激光照射區(qū)時，通過激光激發(fā)產生散射光。含有熒光的粒子就會表現(xiàn)出其熒光特性。散射光和熒光由光路系統(tǒng)（相應的透鏡，濾片和探測器）收集。分光器和濾光片引導散射光和熒光至相應的探測器，把光信號轉換為電信號。,10,11,液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)，其理想狀態(tài)是把細胞傳送到激光束的中心。而且在特定時間內，應該只有一個細胞或粒子通過激光束。 因此，必須在流動室內把細胞注入鞘液流。流動

7、室是液流系統(tǒng)的核心部件，臺式機中流動室稱為樣品槽，大型機稱之為噴嘴。在流動室內細胞液柱聚焦于鞘液中心，細胞在此與激光相交。,12,,Flow Cell,,,,,,,Injector Tip,,,,Fluorescence,signals,,Focused laser,beam,Sheath fluid,,,13,14,高流速適用于定性測量，如免疫表型。樣本流變寬，細胞間距離縮短，這樣在單位時間內流經激光照射區(qū)的細胞數(shù)量增加

8、，可以快速獲取數(shù)據(jù)。 低流速促使樣本流變窄，單個細胞得以依次通過，這樣大多數(shù)細胞可流經激光束的中心，細胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用于檢測分辨率要求高的實驗，如DNA分析。,15,散射光信號和熒光信號的檢測,前向角散射：前向角散射（FSC）光與被測細胞的大小和面積有關，檢測的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向的散射光信號。FSC不受細胞熒光染色的影響，常用于免疫表型分析的信號處理。,16,Forw

9、ard Angle Light Scatter前向角,17,,側向角散射：側向角散射（SSC）光與被測細胞的顆粒密度和內部結構有關，對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感。SSC收集與激光束正交90度方向的散射光信號。,18,90 Degree Light Scatter90度側向角,19,流式細胞儀產生的信號,非熒光信號,顆粒度,,,細胞大小,20,,上述兩種信號都是來自于激光原光束，目前采用這兩個參數(shù)組合，可區(qū)分不同種類的細胞亞群

10、，同時可獲得細胞相關的重要信息，下圖（圖3-2）為FSC和SSC組成的二維散點圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細胞、單核細胞及粒細胞區(qū)分開。,21,,22,熒光信號,熒光物質吸收符合其波長范圍的光能量，內部電子受激上升到高能級。然后受激電子迅速衰落回基態(tài)，釋放過剩能量成為光子。這種能量的轉換稱為熒光。 能夠激發(fā)熒光物質的波長范圍稱為激發(fā)光譜。因為更多的能量消耗在吸收轉換而不是熒光轉換中，所以發(fā)射光波長要高于激發(fā)光波長。熒光物質的發(fā)

11、射波長范圍叫做發(fā)射光譜。,23,,目前的流式細胞儀大多采用氬離子激光器，因為488nm的激光器能夠激發(fā)一種以上的熒光。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質的激發(fā)光譜的峰值，所產生的熒光信號愈強。FITC的激發(fā)光譜如圖3-3所示， 488nm非常接近FITC的激發(fā)光譜的峰值，所以FITC被激發(fā)時會表現(xiàn)出最強熒光信號，而當FITC被其波譜范圍內的其它波長激發(fā)時，也會檢測到熒光，但信號強度不會這么高。,24,,,25,,,26,27,Phycoeryt

12、hrin (PE),,,,,,,,,,,,,,,,,,,400 nm,600 nm,700 nm,,,,,Wavelength,,,,Excitation,Emission,,,500 nm,Fluorescent Dyes,28,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ethidium,PE,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,cis-Parinaric acid,Tex

13、as Red,PE-TR Conj.,PI,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,FITC,,,,,,Common Laser Lines,29,,,30,,對單克隆抗體進行熒光染色，通過分析細胞表面抗原標記確認細胞類型。在細胞的混合群體中，我們使用不同的熒光染料區(qū)分細胞亞群。

14、每個亞群的染色模式與FSC和SSC數(shù)據(jù)相結合，用于識別樣本中的細胞種類，并可以得到各細胞亞群的百分含量。而且，還可以對感興趣的細胞進行再分選。,31,32,,,,,,,,,,,,,,,,,,,PMT,PMT,PMT,PMT,Dichroic,Filters,,,,,,,,,,,,,,,,,,Bandpass,Filters,Example Channel Layout for Laser-based Flow Cytometry,,La

15、ser,,1,2,3,4,Flow cell,,,,,,,,,,,33,,臺式機通常配有兩根激光器：第一根激光器波長為488nm。第二根為波長635nm的紅二極管固態(tài)激光器。,34,數(shù)據(jù)分析,,35,,,Immunophenotyping,,,CD2,,CD4,36,設門 通過設門的方法可以定義細胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細胞群，如果想單獨分析淋巴球細胞，可根據(jù)FSC或細胞大小，在FSC，SSC的散點圖中設門，其數(shù)據(jù)結果只反映淋巴

16、細胞亞群的熒光特性。,37,,,38,,直方圖可直觀單個參數(shù)的細胞數(shù)量。陰性對照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界。左圖中M1為陰性對照峰。右圖中M2為CD3 FITC陽性峰。,39,,,40,,統(tǒng)計結果表明，整個事件共記錄了6000個細胞，門內淋巴細胞2891個。其中M1（陰性）細胞619個，M2（CD3陽性）細胞2272個細胞。淋巴細胞亞群CD3陽性百分含量的統(tǒng)計結果為：M2：2272/2891=78.59%。,41,,二維點圖以雙參

17、數(shù)顯示結果，每個點表示一個或多個細胞。圖為陰性對照圖，用于設定陰性對照邊界，全圖劃分為四個象限，以區(qū)分陰性細胞、單陽性細胞以及雙陽性細胞。左下象限（LL）為雙陰性細胞，左上象限（UL）為Y軸陽性細胞（CD19 PE），右下象限（LR）為X軸陽性細胞（CD3 FITC），右上象限（UR）為雙陽性細胞（CD19+/CD3+）。,42,,如圖5-7所示，淋巴細胞亞群雙陽性細胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839=10.43

18、%。,43,分 選,,44,,,,,,488 nm laser,,-,,,,,,,,,Charged Plates,Single cells sortedinto test tubes,,,FALS Sensor,Fluorescence detector,,,,,,,,,,,Purdue University Cytometry Laboratories,45,流式細胞術的臨床應用,46,1.檢測淋巴細胞亞群，監(jiān)測細胞免疫狀態(tài)2.

19、白血病/淋巴瘤免疫分型 3.HLA組織配型及HLA與某些疾病的關系4.干祖細胞的定量及成分分析.5.其它:血小板PAIg：粘附分子;TCR多態(tài)性檢測; 腫瘤癌基因及 抑癌基因蛋白產物的檢測;細胞內酶;耐藥蛋 白的分析等等。,臨床常見應用,47,HLA-B27檢測 外周血HLAB27的表達及其表達程度與強直性脊柱炎的發(fā)生有很大程度的相關性.循環(huán)血中活化血小板（CD62P、CD63）：

20、 糖尿病伴微血管病變、冠心病、高血壓病、高脂血癥、腦血栓形成、短暫性腦缺血發(fā)作、腦動脈硬化患者活化血小板百分率和絕對值顯著高于正常人。而糖尿病無微血管病變、周圍血管病變以及深靜脈血栓形成患者活化血小板水平與正常人無顯著差異。PTCA后24小時發(fā)展成急性血管閉塞或高度再狹窄的患者活化血小板CD62p、CD63增多，可以用于預測PTCA后急性缺血再發(fā)作的危險性。,48,微轉移腫瘤細胞,靈敏度:10-7,49,細胞周期分析:在細胞周期(G0，

21、G1，S，G2 ，M)的各個時期，DNA的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過核酸染料標記DNA，并由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細胞的周期分布及細胞的增殖活性。也可利用細胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，對細胞周期進行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.,DNA含量及細胞周期分析,50,,,,,,,,,,,,G2,M,G0,G1,s,0,

22、200,400,600,800,1000,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,s,DNA Analysis,DNA content,Count,Normal Cell Cycle,51,0,200,400,600,800,1000,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2N,4N,Counts,G0/G1,G2/M,S,,,,,PI 熒光強度(DNA含量),流式DNA周期示意圖,52,定量分析,1.檢測細胞特異

23、性標記物：FCM不但可以定性分析標記物，而且可以進行定量。用標記已知數(shù)量的熒光素分子的標準微球作參照，可以計算出每個細胞抗原定簇的個數(shù)。 2.CD4絕對計數(shù) 3.CD34絕對計數(shù) 4.血小板絕對計數(shù) 5.可溶性物質(如細胞因子)的高通量定量檢測,53,血小板計數(shù)新標準(雙平臺法),,,,,R = 紅細胞數(shù)R3/血小板數(shù)R1(流式),血小板數(shù)=紅細胞數(shù)(血球儀)/R,(國際血液學標準化委員會(ICSH)/國際實驗血液學協(xié)會(ISL