血清白球蛋白的分離、純化及鑒定試驗(yàn)用

1、血清白蛋白、γ-球蛋白的分離、純化及鑒定,目的要求,(一)掌握分離純化蛋白質(zhì)的基本原理。(二)了解柱層析技術(shù)。,（一）分離純化的意義,①?gòu)纳锊牧现蟹蛛x制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。③醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要,（二）分

2、離純化的要求,1、純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究蛋白和一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達(dá)到一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過(guò)程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。,（三）分離純化的一般程序,生物大分子的分離純化

3、一般可分為以下幾個(gè)階段： ①材料的選擇和預(yù)處理 ②破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r(shí)還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離） ③分離純化：包括粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離其中前兩個(gè)階段為生物大分子分離純化的前處理。,選擇材料,破碎細(xì)胞,提取,分離純化,分析及鑒定,,,,,常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù),溶解度,鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀,分子大小,透析、超過(guò)濾,密度梯度離心、凝膠過(guò)濾,帶電特性,電泳、離子交換層析,吸附特性,吸附層析,對(duì)配體分子的親

4、和性,親和層析、金屬螯合層析,一、鹽析（中性鹽沉淀）,在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過(guò)程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離。鹽析法的優(yōu)點(diǎn)： ①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。 ②操作簡(jiǎn)單、安全。 ③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。,鹽析的基本原理,蛋白質(zhì)水溶膠的穩(wěn)定因素：水化膜和電荷。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。 破壞水化膜，暴露出疏水區(qū)域

5、， 中和電荷，破壞親水溶膠,,,,,,溶解度,鹽濃度,Salting-out,Salting-in,,,+,+,+,+,+,+,+,+,,,,,,+,+,+,+,+,+,+,+,,,,,,,,,,,等點(diǎn)電時(shí)的蛋白質(zhì)（親水膠體）,帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）,脫水,脫水,脫水,帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）,不穩(wěn)定蛋白顆粒,陰離子,陽(yáng)離子,堿,酸,酸,蛋白質(zhì)聚集沉淀,帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）,堿,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

6、,,,,,,,+,+,,水化膜,帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）,中性鹽的選擇,常用的中性鹽：(NH4)2SO4 1) 溶解度大：,0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3

7、 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 硫酸銨在0℃時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類,2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一 步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了四倍。3) 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有 的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L濃度的（NH4）2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。4) 價(jià)格便宜

8、，廢液不污染環(huán)境。,分段鹽析,不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。,血清,,球蛋白,,清蛋白,(NH4)2SO4,50%飽和度,飽和,析出,析出,1) 清蛋白等電點(diǎn)是4.0，α2球蛋白等電點(diǎn)是5.06，β球蛋白等電點(diǎn)是5.1，γ球蛋白等電點(diǎn)是7.1。 2) 清蛋白的分子量遠(yuǎn)小于球蛋白,色 譜 法ch

9、romatography,脫鹽和純化——,,1906年俄國(guó)植物學(xué)家米哈伊爾.茨維特,,一．基本概念,色譜法：利用混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異（吸附力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、電荷等），使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相叫固定相，另一個(gè)相流過(guò)此固定相叫流動(dòng)相。由于各組分受流動(dòng)相作用產(chǎn)生的推力和受固定相作用產(chǎn)生的阻力不同，使各組分產(chǎn)生不同的移動(dòng)速度，從而使結(jié)構(gòu)上具有微小差異的各組分得到分離的過(guò)程，稱之為色譜

10、法。,二．特點(diǎn),1、高效能2、高度選擇性3、高靈敏度4、操作簡(jiǎn)單不足之處：定量精確，但定性較差,,,色譜,三、色譜的種類,氣相色譜,液相色譜,氣－液色譜,氣－固色譜,液－液色譜,液－固色譜,,1、吸附色譜法2、分配色譜法3、離子交換色譜法4、凝膠色譜法5、親和色譜法,按原理分類,二、脫鹽（凝膠層析法）,透析——只用于除鹽類和小分子雜質(zhì),超過(guò)濾——除小分子雜質(zhì)，分離、濃縮蛋白質(zhì),,,,加壓,,蛋白質(zhì)溶液,,半透膜,,支持膜

11、的柵板,,超濾液,凝膠層析,又叫分子篩層析。 具備條件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子篩： 葡聚糖凝膠（Sephadex） 型號(hào)：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分離大蛋白質(zhì)、小蛋白質(zhì)，除鹽 瓊脂糖凝膠（瑞典Sepharose、美國(guó)Bio-GelA） 孔徑大，用于分

12、離大分子物質(zhì) 聚丙烯酰胺凝膠（ Bio-GelP）,原理： 1、分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來(lái)，所以大分子物質(zhì)遷移速度快； 2、小分子物質(zhì)要通過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，所以小分子物質(zhì)遷移速度慢。,離子交換色譜（ion exchange chromatography）,以離子交換劑為固定相，利用樣品中不同的生物大分子的帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑吸附強(qiáng)弱不同，而將混合物

13、中的不同離子進(jìn)行分離的色譜技術(shù)。,三、純化（離子交換色譜法）,陽(yáng)離子交換劑（cation exchanger）,兩種離子交換劑,陰離子交換劑（anion exchanger）,R­SO3－H+ + Na+←→R­S O3 Na+ + H+,R­NH4＋ OH－+Cl－←→R­NH4+ Cl－+OH－,離子交換劑的化學(xué)成分,1、樹脂類：分離氨基酸，孔徑?。?2、纖維素類：分離蛋白質(zhì)，孔徑

14、大。通過(guò)改變鹽濃度，輔助改變pH值進(jìn)行梯度洗脫。,陽(yáng)離子交換基,強(qiáng)酸性，聚苯乙烯樹脂,弱酸性，羧甲基纖維素,弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂,陰離子交換基,強(qiáng)堿性，聚苯乙烯樹脂,弱堿性，二乙氨乙基纖維素,陽(yáng)離子交換層析過(guò)程,離子交換樹脂,蛋白質(zhì),,,高離子強(qiáng)度洗脫液洗,高離子強(qiáng)度洗脫液洗,加樣,,平衡液洗,,,,,收集,球蛋白中： α及β球蛋白的pI＜6.5，帶負(fù)電 而γ球蛋白的pI＞6.5(pI7.3) ，

15、帶正電 γ球蛋白先洗脫出來(lái)。白蛋白中： α、β及白蛋白均帶負(fù)電，掛于柱上 先用低鹽洗去α、β球蛋白 再用高鹽競(jìng)爭(zhēng)洗下白蛋白,DEAE纖維素陰離子交換層析:,本次實(shí)驗(yàn)純化采用,操 作,一、鹽析 －－ 白蛋白、γ球蛋白的粗分離 取0.5ml血清 取0.5ml飽和(NH４)２SO４溶液， 緩慢滴入，邊加邊搖。 混勻后于室溫中放置10分

16、鐘。 8000r/min×10min 小心吸取上清液，作為純化白蛋白用。 沉淀加0.5ml蒸餾水，使之溶解，作為純化 γ球蛋白用。,洗脫液中蛋白質(zhì)及鹽分的檢查,取96孔板一塊，上四排加300g/L三氯乙酸溶液 ，下三排加BaCl2液。從下端管口取1滴洗脫液，滴于300g/L三氯乙酸中，出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有蛋白質(zhì)析出。從下端管口取1滴洗脫液，滴于BaCl2中，出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有鹽分析出，不再收集。

17、,二、G-25凝膠層析脫鹽,（一）葡聚糖凝膠G-25層析柱的制備,（二）上樣與洗脫：,1、小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上緩沖液面剛好下降到凝膠床表面(注意不要使液面低于凝膠床表面以致空氣進(jìn)行凝膠床)。2、關(guān)緊下端出口，用滴管吸取鹽析球蛋白液，小心緩慢的加到凝膠床表面上(注意不要將凝膠粒中沖起或破壞凝膠床表面的平整)。,3、開下端出口，使樣品進(jìn)入凝膠床（剛好下降到凝膠床表面），關(guān)閉出口，小心加入適量pH6.5的0.02mol/L NH4

18、Ac緩沖液。4、放開，流速約20滴/分鐘，立即收集并檢測(cè)， 20％磺基水楊酸檢測(cè)到蛋白后收集三管，10滴/管。 顏色最深而且無(wú)渾濁的管用于下一步操作。5、 BaCl2檢測(cè)出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有鹽分析出，不再收集。6、平衡再生：繼續(xù)洗脫30ml。7、白蛋白樣品脫鹽。 15滴/管收集,三、純化（陰離子交換層析）,將脫鹽后含球蛋白的溶液加于DEAE纖維陰離子交換柱上，用0.02mol/L NH4Ac緩沖液洗脫，分管收集洗脫液。檢測(cè)

19、到蛋白后立即收集三管，10滴/管，編號(hào)。（純化的γ-球蛋白）繼續(xù)洗脫30ml將脫鹽后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/L NH4Ac洗脫30ml。改用0.3mol/L NH4Ac洗脫，檢測(cè)到蛋白后立即收集三管，15滴/管，編號(hào)。（純化的白蛋白）再生： 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4Ac 20ml， 0.02mol/L NH4Ac 40ml。,四、醋酸纖維素薄膜電泳檢查,（1）血清（2）粗分的γ

20、-球蛋白液（3）粗分的白蛋白液（4）純化的γ-球蛋白液（5）純化的白蛋白液,樣品：,以醋酸纖維薄膜為支持物，在pH=8.6的巴比妥緩沖液中，血清蛋白的PI均小于8.6，帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)，由于遷移率不同而被分離。,實(shí)驗(yàn)原理,,1．準(zhǔn)備與點(diǎn)樣2. 電泳（點(diǎn)樣面朝下，110V 1h）3．氨基黑10B染色5分鐘4. 漂洗,,,2cm,,粗糙面,操作步驟,學(xué)號(hào),（1）血清（2）粗分的γ-球蛋白液（3）粗分的白蛋