液相色譜法對(duì)不同狀態(tài)蛋白的快速分離和鑒定.pdf

1、基因重組蛋白的復(fù)性問題是生物工程下游技術(shù)中的一個(gè)瓶頸。對(duì)于蛋白復(fù)性過程中所形成的中間體(M state)的研究是解決促進(jìn)蛋白進(jìn)行正確折疊的關(guān)鍵。蛋白折疊色譜是近年來出現(xiàn)的一個(gè)新的復(fù)性方法，它不僅可以實(shí)現(xiàn)蛋白折疊過程中不同分子構(gòu)象狀態(tài)的分離，而且該方法也可用于研究蛋白的分子構(gòu)象變化，并用計(jì)量置換理論(stoichiometric displacement theory，SDT)中的兩個(gè)線性參數(shù)z和log/對(duì)蛋白變性及復(fù)性過程中產(chǎn)生的不同分

2、子構(gòu)象狀態(tài)其進(jìn)行表征，所以用蛋白質(zhì)折疊液相色譜法和SDT來對(duì)蛋白折疊及折疊中間體進(jìn)行研究是當(dāng)前生物技術(shù)中的一個(gè)新方法。二維及多維液相色譜法已成為分析化學(xué)中復(fù)雜體系組分分離和分析的強(qiáng)有力工具，尤其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中對(duì)整體(intact)天然蛋白(N態(tài))的預(yù)分離方面。由于傳統(tǒng)的二維及多維液相色譜本身存在的一些缺陷而限制了其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的廣泛應(yīng)用，因此對(duì)二維液相色譜方法的改進(jìn)及發(fā)展目前仍為國(guó)內(nèi)外蛋白組學(xué)及色譜研究的熱點(diǎn)之一。

3、論文包括以下5個(gè)部分： 1.文獻(xiàn)綜述：蛋白折疊過程中產(chǎn)生的中間體在很大程度上阻礙了變性蛋白(U態(tài))向具有生物活性的天然態(tài)的轉(zhuǎn)變，而且由于中間體的壽命非常短使得難以對(duì)其進(jìn)行分離和捕獲，因此對(duì)蛋白折疊及折疊中間體的研究具有重大的理論意義和重要的實(shí)際價(jià)值，目前的研究還一直處于經(jīng)驗(yàn)摸索的階段。本文從蛋白折疊及折疊中間體形成的原因、研究策略、方法及進(jìn)展進(jìn)行了全面地綜述。在二維液相色譜(tWO dimensional liquid chro

4、matography,2DLC)方面，全面介紹了目前二維及多維液相色譜(MDLC)發(fā)展的方向以及存在的問題，共包括文獻(xiàn)160篇。 2.用疏水相互作用色譜法對(duì)脲變 -糜蛋白酶(a-Chy)折疊中間體進(jìn)行了研究，通過HIC在動(dòng)態(tài)條件下在線制備和純化出一個(gè)穩(wěn)定的a-Chy中間體。在不同的脲變條件下測(cè)定了天然和中間體a-Chy的Z、lgI和j值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脲濃度不同時(shí)，天然和中間體a-Chy與固定相表面的這三個(gè)不同參數(shù)有很大區(qū)別，其中

5、天然a-Chy的z和lgI之間有很好的線性關(guān)系，而中間體卻沒有，并且中間體的Z和lgI值要比天然態(tài)的小得多，根據(jù)這三個(gè)參數(shù)的不同可以用來區(qū)分蛋白的不同分子構(gòu)象狀態(tài)，建立了一個(gè)在線折疊液相色譜表征a-Chy中間體的新方法。 3.以脲變 - 糜蛋白酶(a-Chy)為模型蛋白，用蛋白折疊液相色譜法研究了該蛋白在6種不同固體表面上的折疊及其在折疊過程中形成的中間體，選用疏水相互作用色譜(HPHIC)固定相為吸附劑，在動(dòng)態(tài)條件下著重研究

6、了疏水色譜固定相TSK和PEG-600表面對(duì)脲變a-Chy復(fù)性效率的貢獻(xiàn)。用基質(zhì)輔助激光解吸附離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)3.0 mol/L，脲變a-Chy，在經(jīng)HPHIC柱復(fù)性并同時(shí)分離的收集組分進(jìn)行確認(rèn)后，僅有一種穩(wěn)定的脲變a-Chy折疊中間體。并通過活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)該折疊中間體難以復(fù)性并具有低的生物活性，但PEG-600固定相表面較TSK固定相對(duì)a-Chy復(fù)性效果好。證實(shí)了疏水性強(qiáng)度及固體表面配基的結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白折疊起著關(guān)鍵性的作用。 4

7、.通過實(shí)驗(yàn)合成了三種具有弱陽(yáng)('WCX)和疏水(}tIC)性質(zhì)的雙功能色譜固定相(bi-functional stationary phase)，通過對(duì)這幾種固定相的表征發(fā)現(xiàn)該雙功能固定相無論在IEC模式下還是在HIC模式下對(duì)蛋白都有很高的分辨率，因此這種色譜柱稱之為WCX-HIC柱，并簡(jiǎn)要描述了WCX-HIC柱對(duì)蛋白的分離原理。蛋白在IEC和HIC的保留強(qiáng)弱可以根據(jù)配基的種類，加入的量以及合成條件的不同進(jìn)行控制。實(shí)驗(yàn)測(cè)得該類型的雙功能

8、色譜固定相在兩種模式下都具有很大的動(dòng)力學(xué)吸附量，而且通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的質(zhì)量回收率測(cè)定發(fā)現(xiàn)，這幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別在這兩種模式下的質(zhì)量回收率都大于96％，表明該類型的固定相對(duì)蛋白的不可逆吸附很小。在此基礎(chǔ)上首次提出了用一根色譜柱來實(shí)現(xiàn)離子交換和疏水色譜快速分離整體蛋白的新方法。在選擇合適的固定相、流動(dòng)相、緩沖液交換方法及二次進(jìn)樣的條件下，在1小時(shí)內(nèi)用同一根色譜柱完成了通常用兩根色譜柱和在兩種流動(dòng)相條件才能實(shí)現(xiàn)的“二維色譜”分離，并且能維持蛋白原

9、有的三維和四維分子結(jié)構(gòu)。通過和最好的商品TSK離子交換和疏水色譜柱比較發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)合成的雙功能固定相在單獨(dú)的IEC和HIC模式下可以和TSK柱相媲美。而且從峰容量來看，由于雙功能色譜柱可以用于二維色譜分離，因此在IEC～HIC或HIC～I(xiàn)EC的二維色譜模式下其峰容量(n1×n2)大大超過一根色譜柱，比如TSK柱。 5.首次將合成的雙功能色譜柱用于特殊模式的2DLC蛋白分離，即蛋白單柱二維液相色譜法(two-dimensional

10、 LC by a single column，2DLC-1C)。該2DLC-1C既可以在離線，也可以在在線模式下對(duì)蛋白進(jìn)行分離，后者稱之為在線2DL-1C。通過解決在線緩沖液的快速交換，實(shí)現(xiàn)了大體積的樣品或收集液(0.001～100mL)進(jìn)行連續(xù)或非連續(xù)的在線進(jìn)樣。首次將2DLC-1C用于分析和制備規(guī)模上的在線蛋白二維分離。通過離線和在線模式下實(shí)驗(yàn)了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的二維分離以及對(duì)實(shí)際樣品人血清的快速預(yù)分離，取得了非常滿意的效果。這種2DLC

11、.1C的優(yōu)點(diǎn)有：(1)整個(gè)蛋白分離都是在密封的體系中進(jìn)行的，從而防止了樣品的污染；(2)所有的樣品組分都是定量地轉(zhuǎn)移到下一步的操作；(3)所有的蛋白都保持其天然狀態(tài)；(4)原樣的復(fù)雜性大大簡(jiǎn)化，比如1/10～1/100，甚至更??；(5)每一種蛋白的相對(duì)豐度，尤其蛋白質(zhì)組學(xué)中可以提高低豐度蛋白的濃度10～100倍，甚至更高；(6)容易實(shí)現(xiàn)操作自動(dòng)化；(7)可以在線進(jìn)行天然或整體蛋白的快速分離：(8)該方法不但可以提高信息的可靠性，而且可以