七鰓鰻NF-κB1-like和IκB-ε-like的鑒定以及在固有免疫應(yīng)答中作用的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族蛋白在免疫系統(tǒng)中扮演著一個(gè)重要的角色，它通過調(diào)節(jié)與淋巴細(xì)胞發(fā)育以及生存相關(guān)的一些基因的表達(dá)，來參與免疫應(yīng)答。IκBs家族蛋白作為NF-κB的一種抑制劑，它可以保持NF-κB為一種靜息的狀態(tài)。七鰓鰻作為脊椎動(dòng)物上最低等的一個(gè)物種，為研究脊椎動(dòng)物的起源提供了線索。雖然NF-κB信號(hào)通路在高等脊椎動(dòng)物中研究較多，但是在七鰓鰻中的研究卻未見報(bào)道。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室的工作，我們首次在七鰓鰻的淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)中搜索到了與

2、高等哺乳動(dòng)物NF-κB1和IκB-ε同源的EST序列，并克隆了2個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)，命名為NF-κB1-like和IκB-ε-like。七鰓鰻NF-κB1-like cDNA全長(zhǎng)序列帶有一個(gè)長(zhǎng)度為2940bp，979個(gè)氨基酸的ORF區(qū)。含有一個(gè)171bp5'-UTR和一個(gè)1799-bp的3'-UTR，在3'-UTR末端含有一個(gè)多聚腺苷酸加尾信號(hào)(AATAAA)。七鰓鰻I(yíng)κB-ε-like cDNA全長(zhǎng)序列帶有一個(gè)長(zhǎng)度為272bp，42

3、4個(gè)氨基酸的ORF區(qū)。而且還有一個(gè)354bp5'-UTR和一個(gè)2014-bp的3'-UTR，在3'-UTR末端也有一個(gè)多聚腺苷酸加尾信號(hào)。序列比對(duì)顯示，七鰓鰻NF-κB1-like和IκB-ε-like分別與高等脊椎動(dòng)物中的對(duì)應(yīng)基因有著很高的同源性。NF-κB1-like的N端帶有一個(gè)高度保守N端RHD結(jié)構(gòu)域（Rel同源區(qū)），這是NF-κB家族的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域，在序列的中段含有一個(gè)甘氨酸富集區(qū)(GRR)，在序列的C端，存在7個(gè)高同源性錨定

4、蛋白重復(fù)序列(ANK)。IκB-ε-like在N端含有一個(gè)DSGxxS結(jié)構(gòu)域，其在IκB-ε抑制NF-κB的方面發(fā)揮著重要的作用，在序列的C端含有6個(gè)保守的錨定蛋白重復(fù)序列。進(jìn)化樹分析顯示，NF-κB1-like和IκB-ε-like分別被分到了NF-κB1和IκB-ε的那一簇，并且位于進(jìn)化樹的最底端。
　　構(gòu)建pET32a-NF-κB1-like2，pET32a-NF-κB1-like3和pET32a-IκB-ε-like原核表

5、達(dá)重組質(zhì)粒，進(jìn)行表達(dá)分別得到58kDa，41kDa和36kDa重組原核蛋白。利用親和層析的方法對(duì)這些蛋白進(jìn)行純化，并制備得兔抗IκB-ε-like，兔抗NF-κB1-like2，兔抗NF-κB1-like3和鼠抗NF-κB1-like2多克隆抗體。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，我們制備的抗體既識(shí)別重組表達(dá)的蛋白，也特異性識(shí)別七鰓鰻類淋巴細(xì)胞內(nèi)的蛋白。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明七鰓鰻NF-κB1-like2蛋白具有特異性結(jié)合DNA的功能。構(gòu)建pIRES2-

6、AcGFP1-NF-κB1-like2，pcDNA3.1-NF-κB1-like3和pcDNA3.1-IκB-ε-like真核表達(dá)載體，隨后轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pIRES2-AcGFP1-NF-κB1-like2轉(zhuǎn)染后能夠促進(jìn)L-6,IL-1和TNF-α轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，而當(dāng)共轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP1-NF-κB1-like2和pcDNA3.1-NF-κB1-like3時(shí)這種作用又會(huì)減弱，這表明pcD

7、NA3.1-NF-κB1-like3對(duì)pIRES2-AcGFP1-NF-κB1-like2產(chǎn)生了抑制作用。除此之外，免疫共沉淀暗示，這種抑制通過二者的相互結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。激光共聚焦結(jié)果顯示NF-κB1-like2可以入核表達(dá)，而且同樣這種入核會(huì)受到NF-κB1-like2蛋白的抑制。這一結(jié)果與western blot對(duì)于胞漿蛋白和胞核蛋白的分析相一致。為了研究NLS在NF-κB1-like中的作用，我們構(gòu)建了NLS缺失的突變型質(zhì)粒pIRES

8、2-AcGFP1-NF-κB1-like1。激光共聚焦結(jié)果顯示，缺失了NLS的NF-κB1失去了入核的功能。七鰓鰻淋巴細(xì)胞在LPS持續(xù)免疫的作用下，IκB-ε-like會(huì)隨著時(shí)間的進(jìn)行逐漸降解，這說明其參與了七鰓鰻的固有免疫應(yīng)答且作用方式類似于哺乳動(dòng)物的IκBs家族蛋白。免疫共沉淀和RT-PCR分析，NF-κB1-like和IκB-ε-like并不具有相互作用，并且IκB-ε-like不能夠顯著抑制NF-κB1-like的功能。

9、　　總之，本實(shí)驗(yàn)室首次得到了七鰓鰻NF-κB1-like和IκB-ε-like cDNA全長(zhǎng)序列。NF-κB1-like2通過RHD的結(jié)構(gòu)，可以特異性結(jié)合DNA，并且能夠促進(jìn)IL-6,IL-1和TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)表達(dá)。而帶有ANK結(jié)構(gòu)域的NF-κB1-like3蛋白可以通過和NF-κB1-like2蛋白的相互作用抑制其活性。當(dāng)七鰓鰻淋巴細(xì)胞受到LPS刺激時(shí)，IκB-ε-like會(huì)逐漸降解。對(duì)這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析指出，NF-κB1