干酪乳桿菌遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、乳酸桿菌攜帶不同的質(zhì)粒，尤以θ復(fù)制質(zhì)粒最為常見(jiàn)。本課題從酸奶發(fā)酵劑中分離得到一系列的乳酸菌，對(duì)這些乳酸菌株進(jìn)行質(zhì)粒分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)乳桿菌株含有質(zhì)粒。其中一株乳酸菌菌株含有兩個(gè)不同大小的質(zhì)粒。通過(guò)對(duì)該菌株的16SrRNA測(cè)序分析，并結(jié)合常規(guī)生理生化鑒定，將菌株定名為干酪乳桿菌Lactobacillus casei MCJ(CCTCC AB20130356)。鑒于質(zhì)粒是構(gòu)建穿梭載體的良好元件，我們對(duì)干酪乳桿菌MCJ的小質(zhì)粒（15kb以下）進(jìn)行

2、分離，酶切，并將純化的DNA片段克隆到T載體pMD18T上進(jìn)行測(cè)序，從而得到未知質(zhì)粒的序列。依據(jù)已知序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過(guò)反向PCR擴(kuò)增全質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用DNAstar7.1套件的Seqman進(jìn)行拼接，得到1個(gè)完整的質(zhì)粒序列，該質(zhì)粒的大小為11274bp，G+C百分比為43.89％，攜帶9個(gè)開(kāi)放閱讀框。其中包含完整的海藻糖代謝所需的操縱子基因treR，treB，treC，還包含有兩個(gè)可能的theta復(fù)制子Rep1，rep2.

3、質(zhì)粒命名為pMC11。復(fù)制子rep1由3.5個(gè)正向重復(fù)序列(Direct Repeats，DR)和假定的復(fù)制蛋白基因repA_1，repB組成?？赡艿膹?fù)制起點(diǎn)為oriV1。復(fù)制子rep2由4.5個(gè)正向重復(fù)序列和假定的復(fù)制蛋白基因repB_1，repA組成。通過(guò)克隆復(fù)制子oriV1和ori V2，與來(lái)自pMG36e的紅霉素基因Em、pUC18的復(fù)制子構(gòu)建大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒pEL5.6，pEL5.7。
　　本研究通過(guò)連續(xù)的42℃

4、高溫傳代消除質(zhì)粒，得到不含pMC11質(zhì)粒的菌株L.casei MCJ△1。同時(shí)，為了找到最小的復(fù)制單位，通過(guò)對(duì)包含復(fù)制子的不同長(zhǎng)度片段克隆，構(gòu)建一系列質(zhì)粒。以L.casei MCJ△1為受體菌，轉(zhuǎn)化子結(jié)果分析表明，rep1的最小的復(fù)制單位為:由repA_1和ori V2組成，repB是非必須蛋白。而對(duì)于rep2，兩個(gè)復(fù)制蛋白基因repB-1、repA和oriV1組成最小復(fù)制單位。電轉(zhuǎn)化不同的受體菌株發(fā)現(xiàn)，pEL5.6能在干酪乳桿菌Lac

5、tobacillus casei MCJ△1、L.casei NJ、L.paracasei LPC-37、L.delbrueckii subsp.lactic LBCH-1中復(fù)制傳代，而pEL5.7僅僅能在L.casei MCJ△1、L.delbrueckii subsp.lactic LBCH-1中復(fù)制傳代。對(duì)質(zhì)粒的穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，在非選擇條件下，每代質(zhì)粒丟失率低于1％，表明兩個(gè)穿梭質(zhì)粒在干酪乳桿菌中都十分穩(wěn)定。此外，pEL5.7在乳

6、酸德氏乳桿菌中穩(wěn)定性也很高，每代質(zhì)粒丟失率低于3％。通過(guò)比較不同的啟動(dòng)子的活性，最終選擇嗜酸乳桿菌的S層蛋白啟動(dòng)子SlpA，連同多克隆位點(diǎn)和終止信號(hào)tt，構(gòu)建了兩個(gè)表達(dá)質(zhì)粒pELX1和pELX2。用增強(qiáng)的綠色熒光蛋白eGFP作為標(biāo)記，檢測(cè)了外源蛋白在胞內(nèi)表達(dá)狀況。分析表明，不同菌株中GFP的表達(dá)與細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期有相關(guān)性。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期熒光強(qiáng)度最高，細(xì)胞生長(zhǎng)后期雖然總蛋白量增加，但熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)熒光減弱，說(shuō)明SlpA啟動(dòng)子在干酪乳桿菌中能正