微流控芯片高效捕獲乳腺癌細胞MDA-MB-231及再培養(yǎng)研究.pdf

1、近年來，乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，大多與抑癌基因發(fā)生基因突變密切相關，從而導致正常細胞癌變。惡性腫瘤的轉移是癌癥患者病情復發(fā)或者死亡的主要原因。傳統(tǒng)的用于檢測腫瘤的方法如血清腫瘤標志物和影像學診斷對腫瘤發(fā)生早期的檢出率均較低，所以有效地檢測腫瘤早期的微小轉移一直是臨床醫(yī)學面臨的挑戰(zhàn)。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是存在于很多腫瘤患者體內(nèi)的腫瘤細胞，它由原發(fā)灶脫落后進入人體循環(huán)或淋

2、巴系統(tǒng)，并通過外周血轉移至遠端的組織或者器官甚至遍布全身。循環(huán)腫瘤細胞具有上皮間質(zhì)轉換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和一些腫瘤干細胞的生物學特性，所以在循環(huán)系統(tǒng)中能夠進入血管、快速增殖并形成轉移瘤。很多研究都表明循環(huán)腫瘤細胞的遷移、粘附等與癌癥的轉移和預后復發(fā)均有密切關系。所以，循環(huán)腫瘤細胞具有很重要的臨床意義，對早期診斷、預后判斷、療效檢測和靶向藥物的開發(fā)等提供理論基礎。在全血中的循環(huán)腫

3、瘤細胞與血細胞數(shù)相比極少，對其進行分離、檢測和純化仍具有一定的挑戰(zhàn)性。目前主要依據(jù)腫瘤細胞的大小、細胞形態(tài)、細胞密度和腫瘤細胞獨特的生物學特性對循環(huán)腫瘤細胞進行分離，包括過濾法、密度梯度離心法、細胞表面電荷法和免疫磁珠法等。對循環(huán)腫瘤細胞的檢測主要從細胞計數(shù)和核酸表達分析兩個方面進行。研究者一直致力于循環(huán)腫瘤細胞的富集、檢測和純化技術的研究，希望能夠找到高效捕獲腫瘤細胞的方法并將其應用于臨床檢測。微流控芯片是近幾年飛速發(fā)展的一種對CTC

4、s進行快速檢測和操控的技術。它具有可控的單元集成模式和微尺度結構，可實現(xiàn)樣品處理、捕獲和檢測一體化，降低試劑和樣品量的消耗，能實現(xiàn)快速、高效、高通量的分析，獲得更多有關CTCs的信息。MUC1是一類高分子糖蛋白，正常細胞中低表達，在癌細胞和癌組織中高表達并以畸形糖基化和糖基化不完全兩種形態(tài)存在，從而使抗原分布在癌細胞表面，可被特異性抗體識別。MUC1與腺癌特別是乳腺癌的癌細胞惡變、轉移和浸潤密切相關，其表達與乳腺癌術后復發(fā)、轉移也具有相

5、關性。
　　本研究利用微流控芯片作為載體，通過對芯片基底表面進行MUC1抗體修飾，利用抗原與抗體相結合的方法，實現(xiàn)了對人乳腺腫瘤細胞MDA-MB-231的特異性捕獲和研究。乳腺腫瘤細胞捕獲的條件和環(huán)境嚴重影響了癌細胞捕獲效率，因此篩選和優(yōu)化捕獲條件對于提高細胞捕獲率很有必要。實驗中從微流控基底表面的粗糙度、微流控孔道的花紋、抗體孵育時間、細胞樣品注入流速、細胞注入芯片后在通道內(nèi)停滯的時間等方面進行捕獲條件優(yōu)化，結果獲得了較高的細胞

6、捕獲率。捕獲后的乳腺癌細胞經(jīng)過分離和再培養(yǎng)，進一步利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)分別分析芯片捕獲是否影響乳腺癌細胞內(nèi)基因表達水平變化。同時對抗腫瘤藥物阿霉素(Doxorubicin)處理的正常和再培養(yǎng)的人類乳腺癌細胞MDA-MB-231中FN1、RUNX2、1TGA6MMP3、LAMB3和ERBB2基因表達進行相對定量分析。實驗結果證明，利用微流控芯片能有效富集腫瘤細胞，捕獲前后細胞內(nèi)