注射型豬小腸黏膜下層復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、大鼠ADSCs體外分離培養(yǎng)及CM-DiI標(biāo)記后的傳代示蹤
　　目的：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)建立一種分離培養(yǎng)大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells；ADSCs）并將其用CM-DiI標(biāo)記的方法，探討CM-DiI標(biāo)記后的細(xì)胞用于傳代示蹤的可行性。
　　方法：在無(wú)菌條件下剝離出大鼠腹股溝處的脂肪組織（去除血管和筋膜）并將其剪碎，Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織，提取出原代細(xì)胞，并進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。對(duì)各代細(xì)胞

2、形態(tài)進(jìn)行觀察，將第3代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定，并將其進(jìn)行成脂成骨分化誘導(dǎo)，以確定培養(yǎng)出的細(xì)胞為ADSCs。用CM-DiI標(biāo)記第3代ADSCs，熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察此代細(xì)胞的熒光標(biāo)記情況，并用流式細(xì)胞儀測(cè)定此代細(xì)胞的標(biāo)記率。將標(biāo)記后的ADSCs繼續(xù)培養(yǎng)并進(jìn)行消化傳代，在傳代至第6代和第9代時(shí)，用流式細(xì)胞儀分別測(cè)定這兩代ADSCs的標(biāo)記率。
　　結(jié)果：在體外成功提取出ADSCs，其呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形、

3、魚群樣、旋渦狀樣的生長(zhǎng)。傳代后的細(xì)胞逐漸純化，并且生長(zhǎng)增殖速度加快，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。第3代ADSCs的表面重要標(biāo)志物CD29和CD90均陽(yáng)性表達(dá)（表達(dá)率分別為95.04％、99.65%），而造血細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45和CD31均陰性表達(dá)（表達(dá)率分別為0.17%、0.20%、0.14%）。ADSCs能進(jìn)行成脂成骨的誘導(dǎo)分化。CM-DiI能成功標(biāo)記ADSCs，標(biāo)記后的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，隨著代數(shù)的增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，至第9代

4、仍未消失。流式細(xì)胞儀測(cè)定傳代后的ADSCs的CM-DiI標(biāo)記率，第3代時(shí)標(biāo)記率為97.09%，第6代時(shí)標(biāo)記率為66.21%，而第9代時(shí)標(biāo)記率仍有37.86%。
　　結(jié)論：大鼠ADSCs具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)增殖能力，其能陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面重要標(biāo)志物，且具有成脂成骨的分化潛能。CM-DiI標(biāo)記ADSCs方便易行，標(biāo)記率高，示蹤效果良好，顯示其可成為細(xì)胞標(biāo)記示蹤的良好熒光染料，能為后續(xù)進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分、注

5、射型SIS與ADSCs的體外共培養(yǎng)
　　目的：制備可注射型的豬小腸黏膜下層（Small intestinal submucosa；SIS），并探討其作為注射型生物支架材料與大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)的體外共培養(yǎng)情況。
　　方法：將培養(yǎng)出的ADSCs用流式細(xì)胞儀進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定和成脂成骨的分化誘導(dǎo)，并將其進(jìn)行CM-DiI熒光標(biāo)記。制備可注射型的SIS并將其與ADSCs復(fù)合培養(yǎng)，HE染色觀察注射型SIS的

6、脫細(xì)胞情況，掃描電鏡和熒光顯微鏡觀察注射型SIS及其與細(xì)胞復(fù)合后的情況。制備100%、75%、50%和25%濃度的注射型SIS材料浸提液，將ADSCs分別在各濃度的材料浸提液下培養(yǎng)，CCK-8試劑盒檢測(cè)ADSCs在第1、3、5、7天的增殖情況和材料的毒性。Live/dead染色試劑盒檢測(cè)ADSCs在100%濃度的材料浸提液中第1、3、5、7天的存活情況。
　　結(jié)果：分離培養(yǎng)出的ADSCs能陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面重要標(biāo)志物且具有成

7、脂成骨的分化能力。HE染色顯示注射型SIS上無(wú)殘留細(xì)胞。掃描電鏡觀察到注射型SIS有較多大小不一的三維孔隙，ADSCs能在材料上很好的黏附，呈橢圓形和條索狀生長(zhǎng)。CCK-8檢測(cè)顯示與材料共培養(yǎng)的ADSCs增殖率提高且材料無(wú)細(xì)胞毒性。Live/dead染色試劑盒檢測(cè)顯示ADSCs在100%材料浸提液中存活良好，并且與在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)第1、3、5、7天的死細(xì)胞比例沒有差別。
　　結(jié)論：注射型SIS有良好的三維結(jié)構(gòu)，無(wú)細(xì)胞毒性，與AD

8、SCs復(fù)合具有良好的生物相容性，其促進(jìn)ADSCs的生長(zhǎng)與增殖，顯示其可作為脂肪組織工程一種注射型的天然生物支架材料，為呈遞細(xì)胞提供一種新的形式。
　　第三部分、注射型SIS復(fù)合ADSCs治療大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：再生醫(yī)學(xué)為燒傷創(chuàng)面提供了多種治療方式，尋找良好的皮膚替代物治療燒傷創(chuàng)面成為一大趨勢(shì)。為此，本文擬探討注射型SIS與大鼠ADSCs二者混合物注射治療大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的可行性。
　　方法：將64

9、只大鼠隨機(jī)分為A組（空白對(duì)照組）、B組（ADSCs組）、C組（注射型SIS組）、D組（注射型SIS﹢ADSCs組），每組16只大鼠，均用100℃沸水作用于大鼠背部皮膚10秒以造模。燙傷后即對(duì)創(chuàng)面邊緣和中心區(qū)域進(jìn)行注射治療，A、B、C、D四組分別注射1ml PBS液，1ml含有2×107ADSCs的PBS液，1ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的注射型SIS，1ml2×107ADSCs和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的注射型SIS的二者混合物，用凡士林紗布和無(wú)菌紗布

10、依次覆蓋創(chuàng)面，透氣膠帶環(huán)繞包扎大鼠軀干。在二者混合物注射治療后的第3、7、14、21天采用大體觀察、創(chuàng)面微血管密度、組織病理學(xué)及組織學(xué)免疫熒光的方法來(lái)評(píng)價(jià)二者混合物注射治療對(duì)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的修復(fù)情況。
　　結(jié)果：二者混合物注射治療后的第3天，A、B、C、D四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為7.75±1.30%，13.90±1.01%，14.7±1.10%，19.14±1.56%；第7天，四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為21.45±1.19%，4

11、1.34±5.80%，40.62±4.93%，58.28±2.62%；第14天，四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為50.91±1.28%，67.15±0.86%，69.54±0.81%，85.31±1.05%；第21天，四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為62.68±3.14%，82.19±1.61%，88.77±0.73%，100±0%。D組創(chuàng)面閉合率較 A、B、C三組均高（P＜0.01）。二者混合物注射治療后的第7天，A、B、C、D四組創(chuàng)面微血管密度分別

12、為（11.5±4.6，24.6±6.3，20.1±9.7，39.2±7.3）個(gè)/cm2，D組微血管密度均大于A、B、C三組（P＜0.05）。HE染色顯示D組新生血管較另外三組多，而炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)最少。呈現(xiàn)綠色熒光的CD31部分能與呈現(xiàn)紅色熒光的ADSCs在同一創(chuàng)面區(qū)域共存，顯示出橢圓狀的新生血管結(jié)構(gòu)。二者混合物注射治療后的第21天，B、C、D三組創(chuàng)面均有新生表皮生成，且D組新生表皮最厚，而A組未見明顯新生表皮生成。呈現(xiàn)綠色熒光的CK10部