自體滑膜間充質(zhì)干細胞-小腸粘膜下層復(fù)合物修復(fù)兔半月板損傷的實驗研究.pdf

1、目的：以經(jīng)體外擴增及細胞因子誘導(dǎo)后已進入軟骨細胞分化譜系的兔自體渭膜間充質(zhì)干細胞(SMSCs)為種子，借助豬小腸粘膜下層(SIS)為支架，以SMSCs-SIS復(fù)合物的形式回植入兔體內(nèi)半月板缺損處，探討以此修復(fù)半月板損傷的可行性。 方法：通過有限稀釋單克隆培養(yǎng)法將兔SMSCs由滑膜組織中分離出來并加以純化，并進一步在體外培養(yǎng)條件下研究其形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、分子表型、增殖動力學(xué)、核型以及致瘤性等基本的生物學(xué)特性；在體外用BMP-2、T

2、GF-β3和DEX協(xié)同刺激SMSCs后，以RT-PCR檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原及軟骨特異性聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的mRNA表達，細胞免疫熒光化學(xué)染色檢測細胞分化過程中Ⅰ、Ⅱ型膠原的表達，堿性甲苯胺藍細胞化學(xué)染色檢測軟骨特異性糖胺聚糖(GAG)的表達，借此判斷BMP-2、TGF-β3和DEX是否能夠誘導(dǎo)SMSCs進入軟骨細胞分化譜系；采用Abraham方法處理SIS，并檢測其生物安全性和組織相容性，評價其作為種子細胞支架的可能性；最后將

3、經(jīng)體外擴增及細胞因子誘導(dǎo)已進入軟骨細胞分化譜系的SMSCs種植在SIS支架上，回植入體內(nèi)，6周、12周后取修復(fù)組織塊行HE染色，堿性甲苯胺藍染色，Ⅰ型、Ⅱ型膠原與S100蛋白的免疫化學(xué)組織染色，探討以此修復(fù)損傷半月板結(jié)構(gòu)和功能的可行性。 結(jié)果：在體外培養(yǎng)條件下兔SMS-Cs的增生分裂能力十分活躍，可以通過離體培養(yǎng)使其實現(xiàn)數(shù)目的擴增；DNA含量檢測、染色體核型分析、荷瘤實驗結(jié)果表明，SMSCs是正常的二倍體細胞，無致瘤性，可作為半

4、月板組織工程的種子細胞。在體外，SMSCs經(jīng)BMP-2、TGF-β3和DEX協(xié)同誘導(dǎo)后14天，RT-PCR檢測到Ⅰ型、Ⅱ型膠原及軟骨特異性聚集蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表達，細胞免疫熒光化學(xué)染色也證實有Ⅰ型、Ⅱ型膠原的表達，同時堿性甲苯胺藍細胞化學(xué)染色也證實有軟骨細胞特異性胞外基質(zhì)GAG成分，以上即證明SMSCs已進入軟骨細胞分化譜系；本實驗制成的SIS經(jīng)組織切片和掃描電鏡的觀察表明是一種海綿樣結(jié)構(gòu)，其表面及內(nèi)部均含有豐富的

5、微孔結(jié)構(gòu)，并與SMCSs有良好的組織相容性，可作為SMCSs的支架材料。SMSCs-SIS復(fù)合物植入半月板缺損區(qū)12周后大體觀察原半月板缺損區(qū)有半月板樣組織生成，HE染色可見纖維軟骨樣結(jié)構(gòu)，周圍膠原纖維結(jié)構(gòu)明顯，排列規(guī)則；堿性甲苯胺藍染色可見藍色異染基質(zhì)-GAG；Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原與S100蛋白的免疫化學(xué)組織染色呈強陽性。而膠原對照及空白對照組則僅見纖維組織樣的修復(fù)組織。 結(jié)論：利用自體SMSCs經(jīng)體外擴增及細胞因子刺激后，以S