染料木黃酮通過Akt-NF-κB通路增敏吉西他濱抑制骨肉瘤增殖和誘導凋亡的研究.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma)是兒童和青少年最常見的起源于間充質(zhì)細胞的惡性骨腫瘤，目前采用新輔助化療、保肢手術等綜合治療方案后，療效有了顯著提高，5年生存率達到65％～75％，但復發(fā)或轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率仍低于20％;對于復發(fā)性或轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的治療，目前匱乏有效手段，預后極差，骨肉瘤化療過程中腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，抑制凋亡，導致惡性增殖，是其治療失敗的重要原因。因此，尋找有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑或化療增敏劑是目前亟需解決的關鍵

2、問題。
　　吉西他濱(Gemcitabine)是一種嘧啶核苷類似物，屬于抗代謝類抗癌藥，已應用于骨肉瘤的實驗及臨床研究。它主要作用于DNA合成期和G1后期，可阻止細胞由G1期進入S期，從而使細胞停滯于G1/S期。吉西他濱在細胞內(nèi)經(jīng)核苷激酶作用轉(zhuǎn)化成具有活性的代謝產(chǎn)物。并且，吉西他濱本身還可增強核苷激酶活性，起到自我增效的作用。研究報道，吉西他濱的單藥化療，療效不盡人意，可能與吉西他濱激活NF-κB通路，促進腫瘤增殖和抑制凋亡，導致

3、腫瘤耐藥相關。因此，抑制腫瘤的增殖和誘導凋亡，探討利用非細胞毒藥物來增敏化療藥物療效，給骨肉瘤的治療帶來新的曙光。
　　黃酮類化合物(Flavonoid compounds)是一類多酚化合物，具有一個共同的碳架結構(C6-C3-C6)，其中心結構是2-苯基-1，4-苯并吡喃酮，能夠降低腫瘤的發(fā)病率，更為重要的是其可以誘導腫瘤的凋亡。研究表明，染料木黃酮(Genistein)具有良好的抗腫瘤作用，能夠抑制Akt/NF-κB通路，通過

4、抑制腫瘤增殖和誘導凋亡來增敏化療藥物療效。
　　Akt/NF-κB通路介導的腫瘤耐藥機制是多方面的，抑制凋亡可能是其重要因素，其可能機制如下:1）NF-κB細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性增強;2）誘導抗凋亡基因Bcl-XL、Bcl-2的表達，抑制腫瘤細胞凋亡;3）促進凋亡蛋白因子Survivin的表達，直接抑制效應分子caspase-7、caspase-3特異性結合，從而抑制凋亡的發(fā)生;4）促進環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase，CO

5、X)的表達，介導腫瘤增殖和凋亡抑制。綜上，Akt/NF-κB通路主要通過抑制腫瘤細胞凋亡導致腫瘤耐藥的產(chǎn)生。因此，Akt/NF-κB通路很可能是腫瘤治療中的有效靶點。
　　鑒于吉西他濱在骨肉瘤治療中的耐藥及染料木黃酮的藥物增敏作用，我們設計了藥物聯(lián)合作用的課題，本課題將主要通過以下兩方面內(nèi)容來研究:第一部分，以骨肉瘤細胞系為研究對象，闡明染料木黃酮增敏吉西他濱抑制骨肉瘤增殖和誘導凋亡的作用及機制。第二部分，建立經(jīng)原位種植的骨肉瘤細

6、胞小鼠模型，以病理組織學方法結合細胞免疫化學染色法研究染料木黃酮和/或吉西他濱作用后，對腫瘤生長的抑制作用，并檢測信號通路，驗證體外實驗結果。
　　第一部分:染料木黃酮增敏吉西他濱抑制骨肉瘤增殖和誘導凋亡的體外研究
　　目的:研究染料木黃酮增敏吉西他濱抑制骨肉瘤增殖和誘導凋亡的作用及機制。
　　方法:實驗分為對照組、染料木黃酮(20μmol/L)組、吉西他濱(0.5μmol/L)組、藥物聯(lián)合4組。通過細胞增殖抑制實驗(

7、MTT)測定對骨肉瘤細胞系的增殖抑制效果;應用電鏡來觀察藥物作用后骨肉瘤細胞的形態(tài)學變化;通過DNA Ladder和TUNEL檢測凋亡現(xiàn)象;流式細胞儀分析凋亡變化;通過RT-PCR、Western blot及免疫共沉淀檢測相關蛋白變化。
　　結果:藥物聯(lián)合組可顯著抑制MG-63、U2OS、MNNG/HOS細胞增殖，可見特征性的DNA ladder條帶，且凋亡率明顯增高。吉西他濱可誘導各細胞系NF-κB激活，促進骨肉瘤增殖和抑制凋亡

8、。而藥物聯(lián)合組明顯降低p-Akt、NF-κB、bcl-2、Bcl-xL、COX-2、survivin等的表達。
　　結論:染料木黃酮可通過Akt/NF-κB通路增敏吉西他濱抑制骨肉瘤細胞的增殖和誘導凋亡。
　　第二部分:染料木黃酮增敏吉西他濱抑制骨肉瘤小鼠腫瘤增殖和誘導凋亡的體內(nèi)研究
　　目的:研究染料木黃酮增敏吉西他濱抑制骨肉瘤小鼠腫瘤增殖的作用及機制。
　　方法:骨肉瘤細胞MNNG/HOS注射于BALB/c小

9、鼠皮下，建立原位骨肉瘤細胞小鼠模型。在骨肉瘤細胞種植后5天，將小鼠隨機分為4組，每組6只。第一組為對照組;第二組為吉西他濱組，吉西他濱80mg/kg隔天腹腔內(nèi)注射;第三組為染料木黃酮組，以染料木黃酮1 mg/天給予每只小鼠灌胃，連續(xù)口服10天;第四組為藥物聯(lián)合組，即言西他濱與染料木黃酮共同作用。所有小鼠在藥物處理后3天后處死，取腫瘤組織并稱重。采用腫瘤體積重量觀察、解剖觀察及組織學染色檢查原發(fā)病灶。以病理組織學HE染色方法檢測骨肉瘤凋亡

10、現(xiàn)象;原位TUNEL檢測骨肉瘤凋亡;結合細胞免疫化學染色法檢測NF-κB及Bcl-xL表達變化;并通過腫瘤組織Western blot和免疫共沉淀檢測p-Akt、NF-κB表達，即驗證體外的抗腫瘤途徑。
　　結果:藥物聯(lián)合能夠明顯降低腫瘤的體積和重量，誘導腫瘤凋亡，NF-κB及Bcl-xL表達明顯下降(p＜0.0001)。吉西他濱可誘導NF-κB激活;而與染料木黃酮聯(lián)合可明顯抑制NF-κB表達，并且p-Akt表達顯著降低。