柴胡疏肝散對APP-PS1 AD小鼠的治療作用和效靶分子網(wǎng)絡探究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)又稱老年性癡呆，是一種以記憶力減退、認知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，病情呈進行性加重。AD的主要病理特征是老年斑、神經(jīng)原纖維纏結、淀粉樣血管病、顆?？张葑冃院痛竽X神經(jīng)元細胞丟失。研究發(fā)現(xiàn)，在65歲以上的患者中，AD女性患者的發(fā)病率為同齡男性的3倍。這可能與女性絕經(jīng)期后雌激素水平減少及雌激素受體(ER)通路改變相關。目前，對AD還沒有有效的治療方法。臨床發(fā)現(xiàn)

2、單一靶點藥物藥效局限且往往毒副作用比較大，于是逐漸轉向多藥物多靶點的聯(lián)合用藥，以提高療效，減輕毒副作用。傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有多成分多靶點的作用特點，隨著大數(shù)據(jù)時代的到來和多學科交叉的快速發(fā)展，給中藥的研究和臨床應用提供了新的思路。中藥復方柴胡疏肝散(CSS)出自《景岳全書》，內含柴胡、香附、川芎、枳殼、芍藥、陳皮和甘草七味中藥。臨床廣泛用于治療胃腸疾病、婦科疾病和精神神經(jīng)系統(tǒng)疾病，療效確切。其成分復雜，作用機制不明。本課題擬通過柴胡疏肝散對A

3、PP/PS1阿爾茨海默病轉基因小鼠認知和學習記憶行為的影響，采用現(xiàn)代的技術和方法從藥理學、藥效學以及腸道微生物的角度闡述柴胡疏肝散的藥物藥效成分和作用機制。為柴胡疏肝散的藥物質量控制、制劑加工和臨床應用提供理論基礎。
　　方法:首先，選用4月齡雄性APP/PS1轉基因小鼠，隨機分為模型組(V)、柴胡疏肝散高劑量組(H，1.4g/kg)、低劑量組(L，0.7g/kg)和西藥安理申(A，2mg/kg)及同窩陰性對照組(C)。每天灌胃給

4、藥一次，連續(xù)給藥8周。采用新物體識別和水迷宮行為學檢測柴胡疏肝散對小鼠認知和學習記憶的影響。免疫組化檢測APP/PS1小鼠腦內老年斑沉積量和雌激素受體表達量。ELISA檢測小鼠腦內海馬和皮層雌激素含量。對實驗小鼠糞便16sRNA基因V3-V4區(qū)做高通量測序，檢測腸道微生物菌群變化。核磁質譜體外檢測腦內NAA、Cr、Cho、Tau等生化指標;檢測肝腎功能評價指標。探討柴胡疏肝散改善APP/PS1小鼠認知和學習能力的作用與機制。然后，構建U

5、FLC-MS/MS聯(lián)用法，檢測蒸汽提取和超聲提取兩種不同提取方法制備的柴胡疏肝散化學成分及其質量，明確柴胡疏肝散中藥效化學成分，建立一個高效、準確的質量檢測手段。為柴胡疏肝散藥材質量控制提供新方法。最后，依據(jù)網(wǎng)絡藥理學方法，通過數(shù)據(jù)庫分析，篩選柴胡疏肝散中符合口服利用度和類藥性規(guī)則的藥效成分，構建成分-靶點網(wǎng)絡，查找柴胡疏肝散藥效成分作用靶點。利用DAVID數(shù)據(jù)庫建立靶點與疾病AD疾病網(wǎng)絡，查找AD疾病相關靶點和通路。使用STRING數(shù)

6、據(jù)庫建立靶點之間的聯(lián)系，用Cytoscape3.2.0分析軟件，建立成分-靶點的關聯(lián)網(wǎng)絡。闡釋柴胡疏肝散藥效成分對AD的作用機制。
　　結果:行為學實驗結果表明柴胡疏肝散和安理申能顯著改善APP/PS1模型小鼠學習和記憶能力。柴胡疏肝散能減少腦內老年斑的沉積，增加小鼠腦內雌激素含量和增加雌激素受體ERβ表達量。核磁質譜顯示腦內生化指標沒有差異改變。肝腎功指標表明柴胡疏肝散的使用劑量對APP/PS1小鼠沒有顯著影響。腸道菌群測序結果

7、發(fā)現(xiàn)，與野生組相比，模型組小鼠的腸道菌群梭菌屬（Clostridium）、厚壁菌門中的羅氏菌屬（Roseburia，屬于毛螺菌科）、Oscillospira、Prevotella、擬桿菌屬（Butyricicoccus）均顯著降低。在種（Species）水平上，與模型組相比，出現(xiàn)擬桿菌屬的一種產(chǎn)丁酸菌（pullicaecorum）在高、低劑量組、野生組和安理申組均顯著升高。分析結果表明，模型組與野生組相比，小鼠出現(xiàn)了菌群豐度和多樣性改變

8、，在藥物干預后，可以逆轉模型小鼠菌群的變化。推斷柴胡疏肝散可以改變APP/PS1小鼠腸道菌群。UFLC-MS/MS質譜聯(lián)用技術結果顯示，該技術對柴胡疏肝散成分和質量檢測效率高，速度快。結果發(fā)現(xiàn)水蒸氣提取法制備的柴胡疏肝散樣品芍藥苷和沒食子酸甲酯含量比超聲提取法高1.5倍，蒸汽提取法制備的樣品中，柴胡的主要成是柴胡皂甙B1和B2，而超聲提取樣品中柴胡D的含量更高。柴胡疏肝散七味中藥已報道的化學成分有670種，符合口服利用度和類藥性篩選條件

9、的有40種，我們的質譜分析結果發(fā)現(xiàn)的17種化學成分中有8種滿足網(wǎng)絡藥理學篩選條件。分別將上述40種和8種成分構建成分-靶點網(wǎng)絡，結果顯示柴胡疏肝散成分槲皮素的作用靶點最多，有384個;在柴胡疏肝散40種成分中有17種作用于ERα/β靶點，且其對應的AD靶點中網(wǎng)絡度最好的是CASP3;在柴胡疏肝散復方的8種成分對應AD相關的25個靶點網(wǎng)絡特征結果顯示，CASP3依然是網(wǎng)絡度最好的靶點，其次為MAPK1、MAPK3、CASP7、CASP8和