AA中miR34a促進(jìn)T細(xì)胞活化和HLa-G抑制B細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景]
　　再生障礙性貧血（再障，aplastic anemia，AA）是一種由多種病因引起的獲得性骨髓衰竭綜合征，臨床表現(xiàn)為不同程度的全血細(xì)胞減少所致的貧血、出血和感染，尤其是重型再障，起病較急，進(jìn)展迅速，重度貧血、臟器出血以及嚴(yán)重感染發(fā)生率高，嚴(yán)重威脅患者的生命安全，是難治性血液系統(tǒng)疾病之一。再障發(fā)病呈世界性分布，國內(nèi)發(fā)病率遠(yuǎn)高于西方國家，并以中青年居多。再障發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，呈明顯異質(zhì)性和重疊性，主要概括為“種子”“土壤”

2、和“蟲子”三個(gè)方面:“種子”造血干細(xì)胞缺陷，包括造血干細(xì)胞量的減少和質(zhì)的缺陷;作為“土壤”的造血微環(huán)境異常，包括骨髓基質(zhì)細(xì)胞和造血生長(zhǎng)因子的異常;而“蟲子”則代表紊亂的免疫功能，異常活化的T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子使造血干細(xì)胞凋亡增多;此外某些遺傳因素也被認(rèn)為與再障的發(fā)病有關(guān)。近年來，隨著免疫學(xué)以及細(xì)胞遺傳學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，再障的發(fā)病機(jī)制的研究獲得長(zhǎng)足進(jìn)步，目前普遍認(rèn)為獲得性再障是一種T細(xì)胞異?；罨瘜?dǎo)致的自身免疫性疾病，免疫攻擊的靶細(xì)胞主要

3、是骨髓中的造血干/祖細(xì)胞。除此以外，許多潛在的自身抗原能夠誘導(dǎo)異常的免疫反應(yīng)進(jìn)而攻擊造血干/祖細(xì)胞，其相應(yīng)的自身抗體已被大量檢測(cè)到，提示B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫在再障發(fā)病中也起到一定作用。
　　MicroRNA(miRNA)是一類序列高度保守的，長(zhǎng)度約為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過和靶基因信使RNA(mRNA)堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻遏其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控，參與生命過程中的許多

4、重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化以及脂肪代謝等。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，越來越多的miRNA分子及其作用被發(fā)現(xiàn)，其中miR146a和miR182分別在固有免疫和適應(yīng)性免疫方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。既往研究表明在一些自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，許多異常表達(dá)的miRNA通過作用于其靶基因參與疾病的發(fā)生發(fā)展，而miRNA與再障的相關(guān)性研究少有報(bào)道。本課題中我們首先收取3個(gè)重型再障患者和3個(gè)健康對(duì)照的骨髓

5、T細(xì)胞，應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)篩選出兩組中差異表達(dá)的miRNA，經(jīng)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證后得出miR34a表達(dá)量在再障骨髓T細(xì)胞中明顯升高，進(jìn)而進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)并建立再障的動(dòng)物模型，探討miR34a及其靶基因在再障發(fā)病機(jī)制中的作用，明確miR34a介導(dǎo)T細(xì)胞活化的分子機(jī)制，為近一步闡明再障的免疫發(fā)病機(jī)制以及再障的靶向治療提供了理論依據(jù)。
　　人白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-G是一種非經(jīng)典的HLAⅠ類基因

6、，不同于經(jīng)典的HLAⅠ類基因，HLA-G表現(xiàn)為低度多態(tài)性，其編碼蛋白主要存在于母胎界面的滋養(yǎng)層細(xì)胞、胸腺、角膜、胰腺以及紅系祖細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞。HLA-G分子有七種異構(gòu)體，包括4種膜表面蛋白和3種可溶性蛋白，通過直接作用于表達(dá)其抑制性受體免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子（immunoglobulin-like transcripts，ILTs）的細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受。ILTs主要包括三種:ILT2(LILRB1/CD85j), ILT

7、-4(LILRB2/CD85d)和KIR2DL4(CD158d)，其中ILT2主要見于NK細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，ILT4主要見于單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。近年來隨著研究深入，HLA-G/ILTs的免疫抑制作用受到越來越多的關(guān)注，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在器官移植、腫瘤、病毒和細(xì)菌感染以及自身免疫性疾病等病理情況下HLA-G蛋白表達(dá)異常，影響T、B、NK等免疫細(xì)胞的正常作用，從而誘導(dǎo)免疫耐受和腫瘤的免疫逃逸等。再障是一種免疫紊亂導(dǎo)致的造血衰竭

8、綜合征，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道HLA-G是否參與再障發(fā)生發(fā)展，本課題通過檢測(cè)再障患者骨髓和外周血細(xì)胞中HLA-G及其受體的表達(dá)情況，初步探討HLA-G/ILTs在再障免疫紊亂中發(fā)揮的作用，有可能為再障的免疫機(jī)制研究開辟新的領(lǐng)域。
　　第一部分:AA中miR34a/DGKζ增強(qiáng)骨髓T細(xì)胞活化的作用及機(jī)制研究
　　研究目的:
　　通過miRNA芯片技術(shù)篩選出AA骨髓T細(xì)胞中異常表達(dá)的miRNA分子，擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證該miRNA分子

9、的表達(dá)量，分析其與臨床特征的關(guān)系，通過臨床標(biāo)本檢測(cè)以及建立再生障礙性貧血的動(dòng)物模型，明確該miRNA分子在AA骨髓T細(xì)胞活化中的作用，近一步確定該miRNA的靶基因并探討其參與T細(xì)胞活化的分子機(jī)制，從而為AA的免疫機(jī)制研究提供新的思路。
　　研究方法:
　　1.標(biāo)本采集:收集49例AA患者和28例健康對(duì)照的骨髓標(biāo)本，其中49例AA患者中包括33位重型再障患者和16位非重型再障患者。
　　2.篩選miRNA分子:取3例重

10、型再障患者和3例健康對(duì)照的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)免疫磁珠分選出CD3+T細(xì)胞，應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)篩選兩組骨髓CD3+T細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA分子。
　　3.驗(yàn)證芯片結(jié)果:實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)法檢測(cè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR34a的表達(dá)情況，并分析miR34a與再障患者臨床特征的相關(guān)性。
　　4.確定miR34a在骨髓na(i)ve T細(xì)胞的表達(dá)情況:免疫磁珠分選8例重型再障患者和8例正常人

11、na(i)ve T和non-na(i)ve T細(xì)胞，應(yīng)用PCR檢測(cè)na(i)ve T和non-na(i)ve T細(xì)胞在兩組中的表達(dá)量，明確miR34a表達(dá)量升高并非AA骨髓T細(xì)胞活化所致的反應(yīng)性升高。
　　5.確定miR34a在AA中發(fā)揮作用的靶基因:應(yīng)用PCR及免疫印跡法(westernblot)檢測(cè)miR34a可能的靶基因二酯酰甘油激酶(diacylglycerol kinase，DGK)ζ在骨髓單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)水平，并分析m

12、iR34a和DGKζ表達(dá)相關(guān)性。
　　6.體外功能實(shí)驗(yàn)探究miR34a在AA骨髓T細(xì)胞活化中的作用
　　6.1慢病毒轉(zhuǎn)染AA骨髓單個(gè)核細(xì)胞:將含有miR34a抑制序列和無義序列的慢病毒轉(zhuǎn)染AA骨髓單個(gè)核細(xì)胞，5天后收集細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　6.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞活化:收集細(xì)胞后標(biāo)記CD4和CD8以及T細(xì)胞活化的標(biāo)志分子CD25和CD69，比較兩組中CD4+和CD8+T細(xì)胞的

13、活化水平。
　　7.比較miR34a基因敲除小鼠(miR34a-/-)和正常野生小鼠(wild-type，WT)在骨髓造血系統(tǒng)的區(qū)別:進(jìn)行外周血細(xì)胞和骨髓造血干/祖細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組外周血、骨髓、脾臟、淋巴結(jié)等處的CD4+和CD8+細(xì)胞的比例。
　　8.小鼠體外功能試驗(yàn)探究miR34a在T細(xì)胞活化中的作用:取miR34a-/-和WT小鼠的脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入anti-CD3和anti-CD8 m

14、Abs刺激T細(xì)胞活化，比較兩組T細(xì)胞活化狀態(tài)、增殖情況以及下游信號(hào)分子的表達(dá)水平。
　　8.1 T細(xì)胞表面活化標(biāo)志檢測(cè):應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞表面CD25和CD69的表達(dá)水平。
　　8.2 T細(xì)胞增殖檢測(cè):應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)直接檢測(cè)兩組T細(xì)胞Brdu的摻入率以及CFSE標(biāo)染后應(yīng)用流式觀察細(xì)胞分裂以明確miR34a對(duì)T細(xì)胞增殖的影響。
　　8.3 T細(xì)胞活化信號(hào)通路中分子檢測(cè):應(yīng)用western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中DG

15、Kζ的表達(dá)量以及下游信號(hào)分子ERK的磷酸化水平。
　　9.構(gòu)建再障的動(dòng)物模型:將miR34a-/-和WT小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)亞致死量照射的半相合受體鼠，監(jiān)測(cè)小鼠血常規(guī)變化，12天后比較兩組小鼠骨髓造血情況以及T細(xì)胞增殖情況。將小鼠股骨進(jìn)行石蠟包埋切片后HE染色觀察骨髓增生情況，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組小鼠骨髓中造血干/祖細(xì)胞比例和數(shù)量，同時(shí)檢測(cè)兩組中T細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果:
　　1.芯片結(jié)果:應(yīng)用芯片技術(shù)在重

16、型再障和健康對(duì)照骨髓T細(xì)胞之間篩選出31個(gè)表達(dá)明顯差異的miRNA分子，其中16個(gè)過表達(dá)而15個(gè)表達(dá)水平降低。
　　2.驗(yàn)證芯片結(jié)果:RT-PCR檢測(cè)miR34a表達(dá)量在AA中明顯升高，且在重型再障組和非重型再障組之間差別較大。同時(shí)miR34a水平與再障患者的外周血中性粒細(xì)胞數(shù)和網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均成反比。但在AA組中miR34a水平在na(i)veT細(xì)胞和non-na(i)ve T細(xì)胞之間無明顯差別。
　　3.確定靶基因:參照

17、既往文獻(xiàn)報(bào)道和生物信息學(xué)軟件分析，選取7個(gè)基因作為候選基因，其中DGKζmRNA水平在AA組中明顯低于健康對(duì)照組且與 miR34a水平成負(fù)相關(guān)，AA骨髓單個(gè)核細(xì)胞中DGKζ蛋白含量亦明顯降低。同時(shí)AA組骨髓T細(xì)胞表達(dá)CD69水平明顯高于對(duì)照組。
　　4.下調(diào)再障骨髓T細(xì)胞中miR34a的表達(dá)量使T細(xì)胞活化水平降低:轉(zhuǎn)入miR34a抑制序列的再障骨髓T細(xì)胞表達(dá)DGKζ明顯增多，其表面CD69和CD25表達(dá)量明顯降低。
　　5.

18、MiR34a-/-小鼠和野生型小鼠骨髓造血細(xì)胞量的比較:miR34a-/-小鼠外周血和骨髓中CD4+T細(xì)胞的比例較野生小鼠明顯降低，而在外周血各系細(xì)胞數(shù)、骨髓有核細(xì)胞數(shù)、骨髓造血干/祖細(xì)胞數(shù)以及CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在脾臟和淋巴結(jié)等處的比例在兩組均無明顯差別。
　　6.MiR34a-/-小鼠的體外功能實(shí)驗(yàn)證明miR34a敲除能夠顯著降低小鼠T細(xì)胞的活化水平和增殖能力:小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞在體外經(jīng)anti-CD3和anti-CD8

19、 mAbs刺激后，miR34a-/-組T細(xì)胞表面的CD69和CD25水平較野生組明顯降低，Brdu摻入率亦明顯減低，CFSE染色顯示miR34a-/-組細(xì)胞分裂率明顯低于野生組。除此以外，作為降解二脂酰甘油(diacylglycerol，DAG)的重要激酶DGKζ在T細(xì)胞活化以后明顯降低，但在miR34a-/-組其降低幅度明顯小于野生組，同時(shí)T細(xì)胞活化信號(hào)通路中的下游分子ERK的磷酸化水平在MiR34a-/-組明顯低于對(duì)照組。
　

20、　7.再障動(dòng)物模型中miR34a敲除使T細(xì)胞功能減弱:應(yīng)用野生型和miR34a敲除的淋巴結(jié)細(xì)胞均可成功構(gòu)建再障動(dòng)物模型，兩種淋巴細(xì)胞均可在受體鼠骨髓中攻擊造血干/組細(xì)胞，但在miR34a-/-組受體鼠骨髓中造血干/組細(xì)胞比例和數(shù)量明顯高于野生組，同時(shí)miR34a-/-組骨髓中CD8+T細(xì)胞比例明顯低于野生組。
　　結(jié)論:
　　1.再障患者和健康對(duì)照的骨髓T細(xì)胞miRNA表達(dá)譜存在明顯差異，提示miRNA分子可能參與AA中T細(xì)

21、胞介導(dǎo)的免疫紊亂。
　　2.逆轉(zhuǎn)AA骨髓T細(xì)胞中miR34a的表達(dá)水平可以明顯降低T細(xì)胞的活化水平。
　　3.再障動(dòng)物模型的建立更加證明了miR34a基因敲除后T細(xì)胞活化增殖能力減弱。
　　4.再障中升高的miR34a通過作用于DGKζ顯著增強(qiáng)了T細(xì)胞的活化水平，從而在AA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，有望成為AA治療的新靶點(diǎn)。
　　關(guān)鍵詞: MiRNA;再生障礙性貧血;T細(xì)胞活化;miR34a; DGKζ

22、>　　第二部分:AA中HLA-G/ILT2抑制骨髓B細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及機(jī)制研究
　　研究目的:
　　明確HLA-G及其受體ILT2、ILT4在AA骨髓和外周血中的表達(dá)情況，探究HLA-G/ILT2相互作用對(duì)AA骨髓中B細(xì)胞的影響以及可能的分子機(jī)制，為再障的免疫機(jī)制研究提供新的方向。
　　研究方法:
　　1.標(biāo)本采集:收集46例再障患者和28例正常對(duì)照的外周血和骨髓，其中包括31例重型再障患者和15例非重型再障患者，

23、分離血漿、骨髓上清和單個(gè)核細(xì)胞。
　　2.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)再障組和對(duì)照組骨髓上清和外周血漿中可溶性HLA-G的水平。
　　3.應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)再障組和對(duì)照組骨髓和外周血單個(gè)核細(xì)胞中HLA-G、ILT2和ILT4在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量。
　　4.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)再障組和對(duì)照組骨髓和外周血單個(gè)核細(xì)胞表面HLA-G、ILT2和ILT4蛋白的表達(dá)量。
　　5.應(yīng)用流式抗體標(biāo)染再障患者

24、和健康對(duì)照骨髓中CD19+B細(xì)胞表面的sIgD和sIgM，以此將CD19+細(xì)胞分為祖/前B細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ILT2在各群細(xì)胞的表達(dá)量。
　　6.體外功能實(shí)驗(yàn):從正常對(duì)照骨髓單個(gè)核細(xì)胞中應(yīng)用免疫磁珠分選CD19+B細(xì)胞，將其種于鋪有OP9基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)板中，同時(shí)加入細(xì)胞因子IL-7、SCF和Flt3-L。實(shí)驗(yàn)組加入重組人HLA-G蛋白或含有高濃度HLA-G的再障患者骨髓上清，通過比較各組B細(xì)胞B

25、rdu的摻入率明確HLA-G對(duì)B細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。除此之外，應(yīng)用anti-ILT2和anti-HLA-G中和抗體阻斷HLA-G/ILT2的結(jié)合，比較阻斷組和非阻斷組B細(xì)胞Brdu摻入率證明HLA-G對(duì)B細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.可溶性HLA-G在再障骨髓上清中明顯高于正常對(duì)照組，但在外周血漿中兩組無明顯差別，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在骨髓上清中可溶性HLA-G水平明顯高于外周血漿，提示可溶性HLA-G在骨髓和外周血中分布不均，

26、在此二處對(duì)免疫細(xì)胞的作用強(qiáng)度可能不同。
　　2.再障組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中ILT2 mRNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，外周血中無明顯差別;同時(shí)外周血和骨髓中ILT4 mRNA的表達(dá)量在兩組中無明顯差異。
　　3.再障組骨髓B細(xì)胞表達(dá)ILT2蛋白的比例明顯高于對(duì)照組，CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞表面ILT2、ILT4蛋白水平在兩組無明顯差異，外周血單個(gè)核細(xì)胞中亦無明顯差異。
　　4.再障骨髓B細(xì)胞各亞群比

27、例呈現(xiàn)異常，成熟B細(xì)胞比例明顯增高，而原/祖B細(xì)胞比例明顯降低;同時(shí)各亞群表達(dá)ILT2的水平有差異，對(duì)照組成熟B細(xì)胞表達(dá)ILT2水平最高，未成熟B細(xì)胞次之，原/祖B細(xì)胞最低，而在再障組成熟B細(xì)胞表達(dá)ILT2水平與對(duì)照組無異，而原/祖B細(xì)胞和未成熟B細(xì)胞表達(dá)ILT2明顯增高。
　　5.HLA-G/ILT2相互作用抑制骨髓B細(xì)胞的生長(zhǎng):與空白對(duì)照相比，與重組人HLA-G蛋白或含有高濃度HLA-G的再障患者骨髓上清共孵育的骨髓B細(xì)胞Br

28、du摻入率明顯降低，而應(yīng)用anti-ILT2或anti-HLA-G抗體干擾HLA-G和ILT2結(jié)合的阻斷組B細(xì)胞Brdu摻入率明顯高于非阻斷組。同時(shí)與富含sHLA-G的再障骨髓上清共培養(yǎng)的正常骨髓B細(xì)胞的Brdu摻入率較加入正常對(duì)照骨髓上清組明顯下降。
　　結(jié)論:
　　1.具有免疫抑制作用的HLA-G及其受體ILT2在再障骨髓中異常表達(dá)，提示HLA-G/ILT2可能參與再障免疫紊亂狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展。
　　2.體外功能實(shí)驗(yàn)