基于自組裝納米多肽及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞3D打印組織模型的研究.pdf

1、研究背景：
　　我們可以在多種組織中找到間充質(zhì)干細(xì)胞，它是一種擁有多向分化潛能的多功能干細(xì)胞，其具有容易分離擴(kuò)增、多向分化和低免疫原性等特性。研究發(fā)現(xiàn)脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Ad-MSCs)相對于其他干細(xì)胞，具有來源充足，取材方便，低創(chuàng)即得，易分離培養(yǎng)，生物學(xué)性狀穩(wěn)定等特征，因此研究者普遍認(rèn)為其在組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)中是一種更為理想的種子細(xì)胞。
　　構(gòu)成組織工程學(xué)支架的材料需要具備良好的生物相容性，較強(qiáng)可塑性，抗張強(qiáng)度大和無

2、免疫原性等特點(diǎn)。目前制備支架的常用材料包括膠原蛋白酶、聚乳酸、海藻酸鹽等材料。但這些生物材料都其相應(yīng)的局限性，現(xiàn)實(shí)實(shí)驗(yàn)條件下對這些生物材料進(jìn)行可控研究難度較大。近年來，以多肽為基本組成結(jié)構(gòu)單元，依靠納米多肽分子自組裝得到的納米組織工程學(xué)框架材料已成為組織工程領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)，這類納米多肽生物材料具有良好的生物兼容性、降解性，且最為突出的優(yōu)點(diǎn)是其具有生物活性。
　　隨著3D打印技術(shù)的興起和快速發(fā)展，3D打印已開始廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，

3、為精準(zhǔn)化、個(gè)性化醫(yī)療提供條件，現(xiàn)階段對組織工程學(xué)高精密度打印也已進(jìn)入深入的探索和研究。
　　以自組裝多肽納米溶液負(fù)載Ad-MSCs為“生物墨汁”利用3D生物打印技術(shù)打印出三維結(jié)構(gòu)，通過體外培養(yǎng)3D打印模型內(nèi)的Ad-MSCs，并給予不同誘導(dǎo)分化條件，觀察其內(nèi)細(xì)胞的生長狀態(tài)及分化程度，研究功能性白組裝納米多肽作為負(fù)載Ad-MSCs的3D打印材料的可行性，探尋3D打印新的發(fā)展方向。
　　研究目的：
　　本實(shí)驗(yàn)豈在研究以自組裝

4、納米多肽與人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Ad-MSCs)為“生物墨汁”，利用3D打印技術(shù)，制造組織工程學(xué)模型，觀察其內(nèi)細(xì)胞生長狀態(tài)及多向分化能力。希望借此找到新的組織工程學(xué)材料。
　　研究方法：
　　1.分離、培養(yǎng)原代Ad-MSCs，傳代至P2、P3后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫表型鑒定并軟件分析;對細(xì)胞進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色，觀察細(xì)胞微絲形態(tài);對細(xì)胞分別成內(nèi)皮、成骨、成脂誘導(dǎo)分化，并進(jìn)行鑒定。
　　2.用10％蔗糖

5、-去離子水溶液溶解三種多肽（RADA16-Ⅰ、RGD、KLT），分別按所需濃度和體積比混合并原子力顯微鏡（Olympus公司）觀察;將混合溶液放入Transwell成膠，成膠后進(jìn)行掃描電鏡觀察;將三種多肽與細(xì)胞混合并成膠后進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察多肽內(nèi)細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)。
　　3.以自組裝納米多肽、Ad-MSCs混合溶液為“生物墨汁”利用3D生物打印技術(shù)打印組織工程學(xué)模型:打印后切片進(jìn)行鬼筆環(huán)肽熒光染色并觀察;誘導(dǎo)3D模型中的Ad-MSC

6、s成骨和成脂分化，誘導(dǎo)完成后分別進(jìn)行茜素紅S、油紅O染色，并與對比組進(jìn)行染色比較。
　　研究結(jié)果：
　　1.倒置相差顯微鏡下可見Ad-MSCs為梭形，整體呈現(xiàn)出漩渦狀生長趨勢;流式細(xì)胞儀鑒定可見分離、培養(yǎng)的細(xì)胞CD166，CD90，CD29表達(dá)陽性，不表達(dá)CD31、CD34、CD45和HLA-DR，符合Ad-MSCs免疫表型。鬼筆環(huán)肽染色后可見細(xì)胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu);成骨、成脂誘導(dǎo)分化后可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)相關(guān)染色劑著色現(xiàn)象。
　　

7、2.原子力顯微鏡觀察納米多肽溶液，可見其內(nèi)有納米纖維結(jié)構(gòu);納米多肽水凝膠無色透明，含水量豐富;掃描電鏡觀察水凝膠，見其內(nèi)納米纖維結(jié)構(gòu)并有孔隙;細(xì)胞與水凝膠混合成膠并培養(yǎng)后觀察可見其內(nèi)細(xì)胞排列緊密，生長狀態(tài)良好。
　　3.利用“生物墨汁”打印出組織工程模型，切片染色后可見其內(nèi)的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，貼壁緊密。對模型內(nèi)的Ad-MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并分別對實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行相關(guān)染色，茜素紅S染色可見成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組中鈣結(jié)節(jié)形成，油紅O染色可