功能性自組裝多肽水凝膠負載脂肪間充質(zhì)干細胞治療家兔后肢缺血.pdf

1、目的:在應(yīng)用干細胞移植治療缺血性疾病中，改進傳統(tǒng)的局部注射單純干細胞懸液或者動脈腔內(nèi)注射干細胞等方法，使用功能性自組裝多肽水凝膠支架負載脂肪間充質(zhì)干細胞并移植到家兔后肢缺血模型，來觀察功能性自組裝多肽水凝膠負載脂肪間充質(zhì)干細胞移植，相對于單純干細胞移植方案，是否達到更好的治療缺血性疾病的效果，從而為干細胞移植治療缺血性疾病做出新的探索。
　　方法:使用膠原酶消化法從脂肪組織中提取脂肪間充質(zhì)干細胞，行原代培養(yǎng)并傳代擴增，測試其生長、

2、增殖特性并對其進行免疫表型、多向誘導(dǎo)分化鑒定，以證明其干細胞屬性。合成自組裝多肽分子RADA16-Ⅰ和附加VEGF模擬片段的功能性多肽序列KLT，使用生物級無菌超純水溶解多肽粉末，并將RADA16-Ⅰ多肽溶液和KLT多肽溶液以1∶1的體積比例混合制備功能性自組裝多肽RADA/KLT，行超聲混勻、過濾滅菌后，行原子力顯微鏡檢測。將RADA/KLT多肽溶液加入24孔板中的transwell小室，使用PBS通過小室基底膜誘發(fā)多肽溶液自組裝成水

3、凝膠，制備水凝膠樣本行掃描電鏡檢測，而后使用培養(yǎng)基中和水凝膠內(nèi)的成份，來制備可以用來三維培養(yǎng)細胞的水凝膠，并將脂肪間充質(zhì)干細胞接種到不同培養(yǎng)條件的RADA16-Ⅰ和RADA/KLT水凝膠中進行三維培養(yǎng)。使用AO/EB染色法觀察脂肪間充質(zhì)干細胞在水凝膠中的存活情況，以此來探討細胞與水凝膠的相容性、安全性。制作家兔后肢缺血模型，并在術(shù)后對分組的家兔分別移植負載脂肪間充質(zhì)干細胞的功能性自組裝多肽水凝膠、單純脂肪間充質(zhì)干細胞懸液、PBS等，移植

4、后觀察家兔后肢的一般狀況、脈搏、皮溫、血壓等，并行后肢數(shù)字減影動脈造影術(shù)，30d后取后肢肌肉標本切片并行HE染色評估組織存活狀況并作評分，行血管內(nèi)皮細胞免疫熒光染色并計數(shù)染色陽性細胞，行統(tǒng)計學(xué)分析移植負載干細胞的功能性自組裝多肽水凝膠組是否達到更好的治療效果。
　　結(jié)果:貼壁的脂肪間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)了成纖維細胞樣形態(tài)，并逐漸展現(xiàn)出了較高的增殖活性，其形態(tài)和增殖能力在傳代過程中可以維持，流式細胞術(shù)證明了其與脂肪間充質(zhì)干細胞的免疫表型相

5、符，對其進行的成骨、成脂誘導(dǎo)分化均成功。合成多肽并溶解混合后，行原子力顯微鏡檢測顯示了多肽的納米纖維樣結(jié)構(gòu)，其納米纖維直徑、長度均一，PBS成功誘發(fā)多肽溶液自組裝成水凝膠，水凝膠固態(tài)透明、無色、質(zhì)脆，且含水量極其豐富。掃描電鏡檢測水凝膠可見其內(nèi)部為孔隙樣結(jié)構(gòu)，孔徑大小為10-50μ m。對比脂肪間充質(zhì)干細胞在不同培養(yǎng)條件的兩種水凝膠中生長，可見含細胞因子培養(yǎng)基中和的功能性自組裝多肽水凝膠RADA/KLT中，脂肪間充質(zhì)干細胞生長最好，細胞

6、伸展、遷移且互相連接，AO/EB染色可見細胞在水凝膠內(nèi)存活率很高。成功制作家兔后肢缺血模型后，家兔術(shù)側(cè)后肢迅速出現(xiàn)跛行、皮溫低、血壓測不出、無脈等，使用不同的細胞移植方法進行治療30d后，通過一般情況評價、組織切片評分、血管內(nèi)皮細胞計數(shù)等方法，證明了移植負載脂肪間充質(zhì)干細胞的功能性自組裝多肽水凝膠組較單純移植脂肪間充質(zhì)干細胞組對家兔后肢缺血有著更好的治療效果。
　　結(jié)論:使用功能性自組裝多肽水凝膠負載脂肪間充質(zhì)干細胞進行干細胞移植