肝素NDST4催化模式的研究及糖基轉(zhuǎn)移酶活性快速分析方法的建立.pdf

1、肝素(heparin，HP)類藥物作為抗凝血和血栓治療藥物應(yīng)用于臨床已經(jīng)有50余年的歷史，市場(chǎng)需求不斷增長(zhǎng)。目前，HP類藥物原料的生產(chǎn)依然依靠動(dòng)物組織提取，來(lái)源有限而且質(zhì)量不穩(wěn)定。建立安全高效的體外合成HP類化合物的方法代替現(xiàn)有原料生產(chǎn)方式，一直是研究人員努力的方向。經(jīng)過(guò)10余年的努力，酶法合成具有生物活性的HP寡糖的研究取得了突破性進(jìn)展，但現(xiàn)有技術(shù)體系中存在著各種瓶頸問(wèn)題，制約著HP類藥物的規(guī)?；苽?。比如，N位點(diǎn)硫酸化葡糖胺（N-s

2、ulfated glucosamine，GlcNS）直接定位合成困難和催化骨架合成的糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferases，GTs）活性快速分析方法缺失是現(xiàn)有酶法合成技術(shù)體系中亟待解決的兩個(gè)問(wèn)題。針對(duì)上述兩個(gè)問(wèn)題，本論文以提高HP寡糖酶法合成技術(shù)體系的效率和規(guī)?；瘧?yīng)用潛力為目的，完成了兩部分工作:通過(guò)結(jié)構(gòu)均一確定模式底物，揭示了人源硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)N-脫乙?；?N-硫酸基轉(zhuǎn)移酶4（N-

3、Deacetylase/N-sulfotrans ferase4，NDST4）的催化模式;建立了偶聯(lián)釀酒酵母尿苷二磷酸(uridine diphosphate，UDP)水解酶（yeast nucleoside diphosphatase，YND1）的GT反應(yīng)高通量篩選體系。
　　1.硫酸乙酰肝素NDST4催化模式的研究
　　N-脫乙酰基酶/N-硫酸基轉(zhuǎn)移酶（N-deacetylase/N-sulfotransferase，N

4、DST）是HS生物合成途徑中糖鏈骨架合成完成后的第一個(gè)硫酸化修飾酶，其催化獲得的N位點(diǎn)硫酸化的葡糖胺是后續(xù)一系列硫酸基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖醛酸異構(gòu)酶底物識(shí)別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。HS糖鏈中硫酸根基團(tuán)的排列形式?jīng)Q定了其與蛋白因子的結(jié)合能力，進(jìn)而影響含有該糖鏈的蛋白聚糖的生物活性。因此，系統(tǒng)的研究NDST的底物特異性等催化機(jī)制不但對(duì)揭示HS生物合成控制機(jī)理具有重要的理論價(jià)值，而且相關(guān)結(jié)論可以直接指導(dǎo)HP寡糖的體外酶法合成。
　　人體細(xì)胞內(nèi)存在4種具有

5、不同的底物特異性NDST同工酶，共同調(diào)節(jié)HS的N位點(diǎn)硫酸化修飾。伴隨著結(jié)構(gòu)均一確定的HS寡糖酶法合成體系的建立，NDST1的催化模式已被充分闡明。但NDST其他3種同工酶的催化模式還未被充分研究。論文利用由昆蟲(chóng)桿狀病毒系統(tǒng)(baculovirus expression system)表達(dá)的重組NDST4與一系列化學(xué)結(jié)構(gòu)確定的模式底物，在體外模擬HS生物合成過(guò)程中N位點(diǎn)硫酸化修飾過(guò)程，通過(guò)解析反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，揭示了NDST4的催化機(jī)制。論

6、文研究結(jié)果表明:(1)單獨(dú)的重組NDST4不具有N-脫乙?；富钚?(2)NDST4具有較強(qiáng)的N-硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性;(3)與NDST1隨機(jī)結(jié)合底物糖鏈中的GlcNAc位點(diǎn)，定向催化的模式不同，NDST4的N-硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性沒(méi)有表現(xiàn)出方向性。基于以上結(jié)論，該同工酶在HS糖鏈的體內(nèi)生物合成中不是調(diào)控糖鏈高硫酸化區(qū)域(NS domain)和低硫酸化區(qū)域(NAc domain)相間排列的關(guān)鍵酶;應(yīng)用方面，NDST4具備成為轉(zhuǎn)化葡糖胺(gluc

7、osamine，GlcN)為N位點(diǎn)硫酸化葡糖胺（N-sulfated glucosamine，GlcNS）工具酶的潛力。
　　2.偶聯(lián)釀酒酵母UDP水解酶的Leloir-GT活性高通量篩選方法的建立
　　GT是生物體內(nèi)負(fù)責(zé)催化糖苷鍵合成酶類，它不但是糖生物學(xué)研究重點(diǎn)之一，而且是糖生物工程重要的工具酶分子之一，廣泛用于體外糖鏈及糖綴復(fù)合物的酶法制各。絕大多數(shù)GT需要以核苷活化的單糖為給體，被稱為L(zhǎng)eloir-GT。但嚴(yán)格的底物

8、特異性限制了天然GT酶分子合成能力，產(chǎn)生了“糖鏈及其復(fù)合物的應(yīng)用價(jià)值”與“酶法合成能力缺陷”的矛盾。以酶法合成HP寡糖技術(shù)體系為例，骨架合成工具酶分子巴斯德氏菌（Pasteurella multocida）肝素前體聚合酶2(pmHS2)嚴(yán)格的單糖供體選擇性是制約現(xiàn)有體系效率的瓶頸之一。利用蛋白質(zhì)工程改造該GT的底物選擇性是突破艾杜糖醛酸(iduronic acid，IdoA)轉(zhuǎn)化這一瓶頸問(wèn)題的有效手段。定向進(jìn)化的成功在很大程度上依賴于針

9、對(duì)GT活性的高通量篩選方法的建立。當(dāng)前大多數(shù)Leloir-GTs活性測(cè)定方法基于質(zhì)譜和色譜分離方法等復(fù)雜儀器或方法，不滿足pmHS2分子定向進(jìn)化的要求。
　　針對(duì)以上問(wèn)題，論文在可溶性重組表達(dá)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）高爾基體膜蛋白UDP水解酶(YND1)的基礎(chǔ)上，建立了一種Leloir-GT活性高通量篩選方法。我們通過(guò)將YND1對(duì)UDP的水解反應(yīng)、Leloir-GT反應(yīng)和PO32-的磷鉬藍(lán)顯色反

10、應(yīng)偶聯(lián)起來(lái)建立了一個(gè)簡(jiǎn)便、靈敏、快速的高通量篩選體系，并用GAG骨架合成中最重要的3種GTs共同驗(yàn)證了該體系的有效性和普適性。具體研究?jī)?nèi)容包括:(1)通過(guò)將YND1(GeneID:856722)第1504-1554位的疏水性跨膜區(qū)用3組甘氨酸-絲氨酸重復(fù)堿基(502F-518H/GSGSGS)進(jìn)行替換的方法，實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母跨膜蛋白YND1以可溶且有活性的狀態(tài)在大腸桿菌中表達(dá);(2)重組YND1的酶學(xué)性質(zhì)研究表明其最佳反應(yīng)條件與大多數(shù)Le

11、loir-GT的理想反應(yīng)條件一致，表明重組YND1催化的核苷酸水解反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)與GT催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)相偶聯(lián);(3)將GT反應(yīng)與重組表達(dá)的YND1偶聯(lián)，優(yōu)化了反應(yīng)與分析條件，建立了一種建立了一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高的GT活性檢測(cè)方法;以糖胺聚糖骨架合成中重要的糖基轉(zhuǎn)移酶KfiA、pmHS2和KfoC為L(zhǎng)eloir-GTs的模式工具酶分子，確定了該方法的有效性;(4)借助YND1偶聯(lián)GT反應(yīng)消除反應(yīng)副產(chǎn)物UDP潛在抑制作用，可以明顯促進(jìn)G