醛縮酶 A 作為肝癌治療新靶點的實驗研究及活性當歸多糖的篩選.pdf

1、背景：
　　作為嚴重危害人民健康的重大疾病之一，惡性腫瘤在我國諸多疾病中導(dǎo)致了最高的人口死亡率。相較于機體正常細胞，腫瘤細胞所特有的生長代謝模式，為其提供了極大的生存和侵襲優(yōu)勢，使得腫瘤細胞對人類健康危害巨大且令人束手無策。早在1927年，Warburg等就觀察到，與正常細胞相比，腫瘤細胞往往能通過糖酵解途徑代謝更多的糖并產(chǎn)生大量乳酸。醛縮酶 A（EC4.1.2.13，ALDOA）是糖酵解和糖異生途徑中的一個重要代謝酶，從而調(diào)控機

2、體能量代謝過程?，F(xiàn)有研究提示，ALDOA在諸多癌癥中過表達，如鱗狀細胞肺癌和結(jié)腸癌，部分腫瘤病人血清中 ALDOA表達明顯增高，表明ALDOA可能是腫瘤發(fā)展和惡變的關(guān)鍵分子。ALDOA不僅在糖酵解中起著重要作用，還參與到細胞其他功能中，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，囊泡轉(zhuǎn)運，細胞運動等。但目前 ALDOA與肝癌發(fā)展的關(guān)系尚不清楚，其能否成為肝癌診斷指標、其抑制劑能否成為抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的候選化合物，還有待于證實。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)：ALDOA能促進

3、肝癌的轉(zhuǎn)移，同時多糖能影響肝癌細胞ALDOA的表達，目前尚無文獻報道相關(guān)工作。
　　目的：
　　本課題擬采用藥理學(xué)和基因干預(yù)（病毒感染）相結(jié)合的手段，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)和相關(guān)細胞功能學(xué)實驗，從分子、細胞和整體動物水平明確 ALDOA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機制，進一步篩選以 ALDOA為治療靶點的抗腫瘤當歸多糖，初步建立以ALDOA為靶點的新藥篩選模型。
　　方法：
　?。?）選取臨床肝癌樣本組織芯片，應(yīng)用免疫組織

4、化學(xué)法（IHC）檢測 ALDOA在人肝癌組織樣本中的蛋白表達，分析其與癌旁組織相比 ALDOA表達的變化；并同時檢測了腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)標志物上皮細胞鈣粘蛋白（ E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）在人肝癌組織樣本中的表達，并運用Spearman相關(guān)性分析法分析其相關(guān)性。（2）肝癌細胞株篩選，檢測不同肝癌細胞株中 ALDOA表達，其中 HepG2細胞在給予高糖刺激后ALDOA表達變化最為顯著；建立ALDOA RNA干擾與過表達

5、HepG2肝癌細胞模型，并用Realtime PCR和蛋白免疫印跡法（WB）檢測重組細胞ALDOA在mRNA水平以及蛋白水平表達差異，驗證過表達和RNA干擾的實驗結(jié)果。（3）觀察 ALDOA對腫瘤細胞侵襲和增殖能力的影響，對四株重組細胞HepG2-ALDOA-NC，HepG2-ALDOA，HepG2-shRNA-NC，HepG2-shRNA-ALDOA通過免疫熒光法（IF）和 WB檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）轉(zhuǎn)移相關(guān)標志物蛋白表達變化；T

6、ranswell細胞侵襲實驗測定細胞侵襲與轉(zhuǎn)移；通過裸鼠皮下移植瘤實驗，繪制腫瘤生長曲線；裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移實驗，處死裸鼠后觀察肝癌細胞血行轉(zhuǎn)移后肺部組織病變情況；進行了細胞生長曲線的測定，流式細胞儀測凋亡。（4）篩選以ALDOA為治療靶點的抗腫瘤當歸多糖，不同當歸多糖組分分別作用HepG2細胞，通過WB檢測細胞內(nèi)ALDOA蛋白水平表達差異，同時觀察當歸多糖對HepG2細胞增殖的影響；通過HepG2-ALDOA細胞明確活性多糖對ALD

7、OA的特異性作用。
　　結(jié)果：
　?。?）在人肝癌組織樣本中，與癌旁組織相比，ALDOA在肝癌組織中的表達顯著增加，Vimentin與E-cadherin的表達也發(fā)生了變化；相關(guān)性分析結(jié)果顯示ALDOA和Vimentin的表達呈正相關(guān)，但ALDOA和E-cadherin的表達呈負相關(guān)。（2）成功構(gòu)建了ALDOA過表達和RNA干擾重組細胞模型。（3）構(gòu)建完成的AIDOA過表達細胞與對照細胞相比，細胞中Vimentin與E-ca

8、dherin的表達發(fā)生了變化，結(jié)果與組織芯片 IHC一致；ALDOA過表達細胞的體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力與成瘤能力均有所增強；其增殖能力、抗凋亡能力，以及細胞遷移能力明顯增強。RNA干擾重組細胞與對照細胞相比，細胞中Vimentin與E-cadherin的表達也同樣發(fā)生了變化；RNA干擾重組細胞的體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力與成瘤能力有所降低；其增殖能力、抗凋亡能力，以及細胞遷移能力相對減弱。（4）當歸多糖組分AAPS-2II能明顯抑制HepG2-ALDOA肝