非編碼RNA參與調(diào)控破骨細胞前體融合及其多種干預(yù)策略的研究.pdf

1、研究背景:骨骼系統(tǒng)是人體的框架，在機體中起到承重，保護各個器官，生產(chǎn)白細胞、紅細胞，儲存礦物質(zhì)以及協(xié)助運動的功能。骨組織雖然是一類堅硬的結(jié)締組織，然而其代謝十分活躍并呈現(xiàn)出動態(tài)平衡的過程。骨重建和代謝的動態(tài)平衡不但維持了骨骼的結(jié)構(gòu)和功能，同時對機體的穩(wěn)態(tài)平衡尤其是鈣磷平衡起到了至關(guān)重要的作用。骨重建的動態(tài)平衡靠骨組織內(nèi)各類細胞的相互協(xié)作來實現(xiàn)。其中成骨細胞(Osteoblast，OB)主要負責骨的合成，而破骨細胞(Osteoclast，

2、OC)則主要負責骨的吸收和降解。兩類細胞通過精細調(diào)控密切協(xié)作共同完成骨組織的重建維持骨穩(wěn)態(tài)。破骨細胞由造血干細胞(Hematopoieticstem cell，HSCs)中的單核/巨噬細胞系分化而來。其分化過程受到多種細胞因子、激素以及理化因素的調(diào)控。成熟的破骨細胞屬于生理性的多核巨細胞，因此由單核前體細胞融合形成多核巨細胞的細胞融合過程是破骨細胞分化過程的關(guān)鍵步驟。融合后的多核成熟破骨細胞具有更高效的骨吸收能力以履行其在骨穩(wěn)態(tài)中的功能

3、。然而，專門針對破骨細胞前體融合的研究甚少，其具體分子機制還十分不清楚。
　　非編碼RNA(Non-coding RNA)是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA。其中包括功能熟知的rRNA，tRNA以及功能還有待探索的microRNA，長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)和環(huán)狀RNA(Circular RNA，CircRNA)等。這些RNA的共同特點是都能從基因組上轉(zhuǎn)錄而來，但是不翻譯成蛋白。在很長一段時間內(nèi)

4、，大部分非編碼RNA都被認為是基因組轉(zhuǎn)錄過程中的“噪音”。然而越來越多的證據(jù)顯示非編碼RNA在分子機制層面，細胞組織層面乃至疾病的發(fā)生過程中都起到舉足輕重的調(diào)控作用。然而對其作用與功能的研究還處在剛剛起步的階段。雖然已有不少microRNA被報道在破骨細胞的分化過程中發(fā)揮重要作用，然而總體來看，非編碼RNA在骨骼系統(tǒng)以及破骨細胞中的研究仍處在萌芽階段。
　　骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)是臨床最常見的骨骼疾病之一，其病

5、理標志為骨鈣鹽與基質(zhì)等比例缺失導(dǎo)致的單位體積內(nèi)骨組織量減少及骨密度降低。在細胞層面上，成骨細胞介導(dǎo)的骨形成減弱和/或破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收增加是其骨質(zhì)疏松發(fā)病的重要機制，可見破骨細胞的功能失調(diào)是其重要的發(fā)病因素。因此，本課題以破骨細胞前體融合為核心研究對象，探索非編碼RNA在破骨細胞分化尤其是破骨細胞前體融合中的作用和具體機制，并以骨質(zhì)疏松為疾病模型，通過非編碼RNA，自然提取物以及材料等多種調(diào)控手段干預(yù)破骨細胞分化過程中的融合步驟以達到

6、治療骨質(zhì)疏松的目的。
　　研究內(nèi)容和結(jié)果:
　　1.破骨細胞體外培養(yǎng)體系模型的建立及其RNA表達譜檢測及功能分析
　　1.1 破骨細胞體外誘導(dǎo)體系模型的建立及評估方法
　　采用3代以內(nèi)小鼠單核巨噬細胞系(RAW264.7)或小鼠骨髓巨噬細胞(Bone marrowmacrophages，BMMs)作為破骨細胞前體細胞。通過誘導(dǎo)因子M-CSF及RANKL誘導(dǎo)兩類細胞向破骨細胞分化。通過調(diào)節(jié)誘導(dǎo)因子的濃度及誘導(dǎo)時間，

7、使用TRAP染色，CFA染色，融合試驗以及噬骨試驗(pit formation assay)定性檢測破骨細胞的分化，融合及功能，將破骨細胞的分化過程分為以下幾個階段:巨噬期(0h)，前體期(24h)，成熟期(72h)和激活期(96h)，以方便后續(xù)研究。
　　1.2 破骨細胞體外誘導(dǎo)模型編碼RNA表達譜的檢測
　　通過qPCR檢測破骨細胞分化過程中各個階段的標志物，特異基因，融合相關(guān)基因和功能基因的表達，目的為進一步驗證體外誘

8、導(dǎo)模型的可靠性。通過及microarray(Agilent)芯片技術(shù)檢測破骨細胞分化過程中各個階段的全基因表達情況，目的為結(jié)合下一步非編碼RNA表達構(gòu)建分析網(wǎng)絡(luò)。
　　1.3 破骨細胞體外誘導(dǎo)模型非編碼RNA表達譜的檢測
　　通過microarray分別檢測以構(gòu)建破骨細胞誘導(dǎo)體系中破骨細胞各個分化階段的miRNA表達譜，lncRNA表達譜，circRNA表達譜。通過Venn分析在組間對比篩選出兩兩之間及各組共同顯著上調(diào)或下調(diào)

9、的miRNA、lncRNA和circRNA，為下一步針對個別非編碼RNA進行驗證提供候選RNA。
　　1.4 mRNA-lncRNA/miRNA-circRNA共表達網(wǎng)絡(luò)的建立及功能分析
　　結(jié)合共同顯著上下調(diào)的mRNA和lncRNA，miRNA和circRNA，通過共表達分析算法，構(gòu)建mRNA-lncRNA共表達網(wǎng)絡(luò)圖，miRNA-circRNA共表達網(wǎng)絡(luò)圖。進而根據(jù)兩者共表達情況采用GO分析，KEGG信號通路分析，初步推

10、測顯著變化非編碼RNA的生物學功能及相互作用關(guān)系。
　　2.非編碼RNA調(diào)控破骨細胞前體融合的分子機制研究
　　2.1 miRNA-7b直接靶向下游融合分子DC-STAMP調(diào)控破骨細胞的融合
　　通過miRNA表達譜及生物信息學分析預(yù)測推測miR-7b可直接靶向破骨細胞融合分子DC-STAMP。通過雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)驗證二者的直接靶向關(guān)系。構(gòu)建慢病毒過表達或抑制miR-7b，將其感染破骨細胞前體發(fā)現(xiàn)miR-7b能夠

11、通過抑制DC-STAMP的表達顯著抑制破骨細胞的分化和融合。
　　2.2 miRNA-18a直接靶向上游關(guān)鍵分子LXR-β調(diào)控破骨細胞的分化和功能
　　為對破骨細胞分化過程中的上游分子進行探索，我們選取了潛在靶向LXR-β的miR-18a進行驗證。我們首先發(fā)現(xiàn)LXR-βKO小鼠在骨量上呈現(xiàn)出降低的趨勢，在雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)驗證了二者的直接靶向關(guān)系后，我們通過提取LXR-βKO小鼠原代BMMs并感染LXR-β過表達慢病毒，

12、使其恢復(fù)對miR-18a調(diào)控的響應(yīng)進一步證明miR-18a直接靶向LXR-β發(fā)揮作用。
　　2.3 lncRNA-AK082203直接靶向轉(zhuǎn)錄因子NFAT1調(diào)控破骨細胞的形成
　　lncRNA-AK082203由表達譜Venn分析篩選出，經(jīng)由共表達分析以及蛋白質(zhì)-RNA互作用分析推測其可能與轉(zhuǎn)錄因子NFAT1密切關(guān)聯(lián)。進一步驗證發(fā)現(xiàn)其能夠通過促進NFAT1的表達進而促進破骨細胞的分化和融合。
　　3.通過干預(yù)破骨細胞前

13、體融合治療骨丟失相關(guān)疾病的研究
　　3.1 通過干預(yù)非編碼RNA調(diào)控破骨細胞前體融合治療骨質(zhì)疏松
　　采用mmu-miR-18a的抑制劑，通過尾靜脈注射入卵巢切除(OVX)骨質(zhì)疏松小鼠體內(nèi)，評估其對小鼠骨質(zhì)疏松的改善情況，通過組織學原位切片破骨細胞特殊染色明確miR-18a抑制劑體內(nèi)對破骨細胞的影響。
　　3.2 通過自然提取物干預(yù)破骨細胞前體融合治療骨質(zhì)疏松及炎癥性骨丟失
　　體內(nèi)外評估抗氧化劑蟲草素對于破骨細

14、胞分化融合及改善OVX小鼠骨質(zhì)疏松的情況;體內(nèi)外評估雙氫青蒿素(DHA)對LPS誘導(dǎo)破骨形成的影響及對LPS誘導(dǎo)的炎癥性骨丟失的改善情況。體內(nèi)外評估花椒毒素通過鈣通道對破骨細胞分化融合的影響及對OVX小鼠骨質(zhì)疏松的作用。
　　3.3 通過納米材料干預(yù)破骨細胞前體融合治療骨質(zhì)疏松
　　檢測石墨烯量子點(GQD)對破骨細胞體外分化的影響，并采用OVX小鼠評估GQD對于治療骨質(zhì)疏松的潛在藥用價值。介于破骨細胞骨吸收微環(huán)境pH低的特

15、殊性，進而采用pH敏感性氧化鈰納米顆粒(CNP)檢測其在不同酶學活性下對破骨細胞分化、融合、功能的影響，提出創(chuàng)新性的給藥模式與治療骨質(zhì)疏松的新策略。
　　結(jié)論:
　　本課題以破骨細胞分化融合為核心研究對象，探索了非編碼RNA在破骨細胞融合分化中的作用及具體影響機制。進而通過人為干預(yù)篩選出的非編碼RNA，自然提取物以及納米材料，體內(nèi)外研究其對于破骨細胞及骨丟失疾病的影響。主要結(jié)論如下:
　　1.破骨細胞在其分化的各個階段

16、，非編碼RNA的表達譜具有明顯的差異性。根據(jù)其表達譜的差異結(jié)合GO&Pathway分析可初步構(gòu)建lncRNA-mRNA，miRNA-circRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，為下一步深入研究非編碼RNA在破骨細胞各個分化階段中的不同作用打下基礎(chǔ)。
　　2.miR-7b直接靶向下游融合分子DC-STAMP抑制破骨細胞的分化融合。miR-18a直接靶向上游分子LXR-β，進而調(diào)控破骨細胞的分化、融合、功能。lncRNA-AK082203通過促進NFA