探討激活HO-1對(duì)利福平所致肝毒性的影響.pdf

1、背景：據(jù)世界衛(wèi)生組織2015年結(jié)核病報(bào)告，全球2014年約有960萬(wàn)人患結(jié)核病，150萬(wàn)人因此喪失生命，給人類(lèi)的健康帶來(lái)極大的威脅。
　　抗結(jié)核化學(xué)藥物療法是重要的結(jié)核病防治武器，但也存在諸多問(wèn)題有待解決。除了耐藥以外，抗結(jié)核藥物的不良反應(yīng)也直接影響結(jié)核病的控制效果，常常使治療中斷或方案更改，導(dǎo)致療效降低和耐藥等。利福平（Rifampicin, RFP）是世界衛(wèi)生組織推薦的、不可替代的一線抗結(jié)核藥，但具有肝毒性。尤其在合用異煙肼（

2、Isoniazid, INH）時(shí)，肝毒性發(fā)生的機(jī)率明顯增加，有時(shí)甚至發(fā)生急性肝衰竭危及生命。然而， RFP引起肝損傷（Anti-tuberculosis drug induced liver injury, ATLI）機(jī)制尚不清楚。有研究表明，氧化應(yīng)激損傷是RFP合用INH致肝毒性的重要機(jī)制。RFP可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450活性加強(qiáng)，增加INH代謝產(chǎn)物生成，從而消耗肝細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽（Glutathione, GSH），最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。<

3、br>　　既往研究表明，血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase-1, HO-1）是血紅素分解代謝的限速酶。它在分解血紅素形成膽紅素的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與了膽紅素代謝的調(diào)控；能保護(hù)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞，是機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷之防御系統(tǒng)中的重要分子。因此，HO-1很可能在RFP肝毒性發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。
　　本研究擬在體外細(xì)胞模型上初步確定RFP對(duì)肝細(xì)胞的毒性效應(yīng)，以及其對(duì)肝臟的氧化應(yīng)激損傷。再?gòu)募?xì)胞和動(dòng)物兩個(gè)水平探討血

4、晶素（Hemin）活化HO-1，探討其是否能在RFP所致肝毒性中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)，為臨床干預(yù)RFP誘導(dǎo)的肝損傷尋找治療靶點(diǎn)。
　　目的：研究激活HO-1對(duì)RFP所致肝毒性的保護(hù)作用。
　　方法：1）體外實(shí)驗(yàn)：不同濃度（10μM、50μM、100μM）RFP處理HepG2細(xì)胞24、48和72h，CCK-8檢測(cè)RFP對(duì)細(xì)胞的毒性作用，并確定藥物作用的最適濃度；檢測(cè)細(xì)胞上清液中ALT、AST含量變化，細(xì)胞裂解液中MDA、GSH-Px、

5、SOD的水平，以此確定是否存在氧化應(yīng)激損傷；激動(dòng)劑Hemin誘導(dǎo) HO-1表達(dá)增加后再次檢測(cè)以上指標(biāo)觀察其變化；RT-PCR、Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白中HO-1表達(dá)情況。
　　2）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：將Balb/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組8只。分別為生理鹽水（Normal Saline, NS）對(duì)照組、DMSO溶劑對(duì)照組、RFP模型組（200mg/kg）、Hemin對(duì)照組、Hemin+RFP干預(yù)組，連續(xù)灌胃15天。檢測(cè)小鼠血清中總

6、膽紅素（Total bilirubin, TB），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase, ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase, AST）；檢測(cè)肝勻漿中丙二醛（ Malondialdehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-Px）水平

7、；HE染色觀察各組病理形態(tài)的改變；Western blot法測(cè)定各組肝組織中HO-1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)：CCK-8結(jié)果表明RFP對(duì)HepG2細(xì)胞毒性作用呈時(shí)間劑量依賴性；RFP組細(xì)胞AST、ALT、MDA明顯升高，而GSH-Px、SOD顯著降低；給予 Hemin預(yù)處理能顯著誘導(dǎo) HO-1的表達(dá)，并對(duì)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，表現(xiàn)為ALT、AST和MDA濃度明顯降低， GSH-Px、SOD活性升高。RT-PCR及We

8、stern blot顯示Hemin預(yù)處理后HepG2細(xì)胞中HO-1表達(dá)明顯增高。體內(nèi)試驗(yàn)：RFP模型組與DMSO溶劑對(duì)照組、NS對(duì)照組相比，總膽紅素、AST、ALT、MDA明顯升高， GSH-Px、SOD顯著降低；Hemin+RFP組較RFP組，AST、ALT、MDA顯著降低，GSH-Px、SOD上升，提示肝臟氧化應(yīng)激損傷程度較 RFP模型組減輕；肉眼觀察，可見(jiàn)RFP模型組小鼠肝臟黃染，肝臟及膽囊腫大，病理切片示RFP模型組小鼠肝臟中央