利福平與異煙肼聯(lián)合應(yīng)用的肝毒性及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：近年來，結(jié)核病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，死亡率居各類傳染病之首。針對(duì)全球結(jié)核病疫情惡化的現(xiàn)狀，世界衛(wèi)生組織(WHO)和世界上許多國(guó)家都重新制訂了結(jié)核病的控制規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)的治療方案，在世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核治療措施中異煙肼(Isoniazid,INH)和利福平(Rifampin，RFP)仍然是不可替代的一線抗結(jié)核藥物。二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)外結(jié)核桿菌有協(xié)同抗菌作用，并減少耐藥性的發(fā)生，但二者合用又可明顯增加肝毒性。目前

2、，INH及其代謝物致肝毒性的作用、RFP對(duì)INH的代謝環(huán)節(jié)的影響機(jī)制等還未完全闡明。本課題擬探討INH與RFP合用致肝毒性增加的部分作用機(jī)理，即INH及其代謝產(chǎn)物對(duì)小鼠肝細(xì)胞的毒性，以及RFP對(duì)INH小鼠肝細(xì)胞代謝的影響。 方法：采用在體心臟灌流法獲取小鼠原代肝細(xì)胞，分兩步灌流，灌流液分別為Buffer I液20mL，以清除血液；含0.05％IV型膠原酶的Buffer II液1mL·min-1灌流至肝臟變軟。肝細(xì)胞分離、純化和計(jì)

3、數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105cells·mL-1于不同培養(yǎng)板中培養(yǎng)并每日觀察。小鼠原代肝細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)5d后，換含INH分別為0.05、1.5、45 mmol·L-1的培養(yǎng)液，乙酰肼(Acetylhydrazine，AHZ)0.05、1、20 mmol·L-1，肼(Hydrazine，HZ)0.05、0.5、5 mmol·L-1的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，MTT法檢測(cè)INH、AHZ和HZ對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞活性及存活率的影響。含INH(87.5μmo

4、l·L-1)、RFP(48.6μmol·L-1)、INH+RFP(87.5μmol·L-1+48.6μmol·L-1)培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞生長(zhǎng)情況。采用柱前衍生化法結(jié)合LC/ESI-MS同時(shí)測(cè)定加藥培養(yǎng)液中INH、AHZ和HZ的濃度。加藥INH N(87.5μmol·L-1)、INH+RFP組(87.5μmol·L-1+48.6μmol·L-1)培養(yǎng)液經(jīng)甲醇沉淀蛋白后，用衍生化試劑3-甲氧基苯甲醛(3-me

5、thoxybenzadlehyde，MBA)進(jìn)行柱前衍生化，衍生化產(chǎn)物以甲醇-5mmol·L-1醋酸銨(pH5.0)緩沖溶液(60:40)為流動(dòng)相，采用Agilent ZorbaxXDB C8柱(5μm，4.6mm×150mm)分離，通過ESI-MS以選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式進(jìn)行檢測(cè)，用于定量分析的離子分別為m/z 256.1[H]+(異煙肼衍生物)，m/z 193.2[H]+(乙酰肼衍生物)，m/z 151.1[H]+(肼衍生物)。

6、結(jié)果：原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)3d后，肝細(xì)胞大多形成集落且融合成片。MTT法測(cè)得與對(duì)照組比較，1.5mmol·L-1的INH使肝細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)；0.05mmol·L-1的AHZ和0.05mmol·L-1的HZ使肝細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，濃度為5 mmol·L-1的HZ處理的肝細(xì)胞存活率只有(68.1±9.1)％；HE染色實(shí)驗(yàn)觀察到INH組細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，核碎裂、邊聚等，INH+RFP組細(xì)胞核染色質(zhì)致密濃

7、縮，核碎裂、邊聚等，或可見凋亡小體，正常對(duì)照組及RFP組則無(wú)上述表現(xiàn)。經(jīng)LC-MS測(cè)定，與INH組比較，INH+RFP組INH含量顯著降低(3.68％，P<0.05)，AHZ含量顯著升高達(dá)(25.70％，P<0.01)，HZ含量顯著升高(2.10％，P<0.01)。 結(jié)論：1.5mmol·L-1的INH，0.05mmol·L-1的AHZ，0.05mmol·L-1的HZ即可抑制肝細(xì)胞的活性，降低肝細(xì)胞的存活率，濃度僅為5 mmol