LASP-1基因沉默對(duì)人口腔鱗癌SCC9細(xì)胞增殖和遷移的影響.pdf

1、口腔癌是威脅人類健康的主要腫瘤之一，已成為全球第九大好發(fā)性腫瘤，其中又以口腔鱗癌居多，具有生長(zhǎng)快速、易侵襲和破壞鄰近組織的特點(diǎn)，并且還可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。雖然外科手術(shù)治療的發(fā)展有了長(zhǎng)足地進(jìn)步，但是創(chuàng)傷大，易復(fù)發(fā)仍是尚未解決的難題，如何尋找到針對(duì)腫瘤的特異性的基因治療已然成為如今的研究熱點(diǎn)。通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)LASP-1（LIM and SH3 protein1）蛋白主要位于肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)域并參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成，在細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)、遷移、黏附等過(guò)程

2、中發(fā)揮重要作用。已有研究指出LASP-1在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤以及肝細(xì)胞癌均呈高表達(dá)，且與患者臨床病理特征相關(guān)。但LASP-1與口腔腫瘤疾病的認(rèn)識(shí)還有待深入，其是否可作為腫瘤基因治療的候選基因仍需探討。
　　目的：
　　由于LASP-1在人口腔鱗癌中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖和遷移能力影響的研究少見(jiàn)報(bào)道。為此本研究采用RNA干擾技術(shù)抑制人口腔鱗癌SCC9細(xì)胞中LASP-1的表達(dá)，觀察LASP-1對(duì)SCC9細(xì)胞增殖

3、和遷移能力的影響。
　　方法:
　?。?）細(xì)胞培養(yǎng)
　　人口腔鱗癌細(xì)胞株SCC9培養(yǎng)于DMEM/f12培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入10％胎牛血清（澳洲），室溫下37°C，5% CO2溫箱培養(yǎng)。
　?。?）慢病毒包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　將病毒包裝輔助質(zhì)粒（pMD2G and PsPAX2）和shRNA表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至人胚腎細(xì)胞293T中。48h后，12000g離心收集。將SCC9以3X104 cells/ml密度接種到6孔板

4、上。以MOI=50的病毒滴度進(jìn)行轉(zhuǎn)染，三天后使用熒光顯微鏡（CKX41， Olympus）進(jìn)行GFP表達(dá)觀察。
　?。?）定量RT-PCR和Western blot測(cè)定LASP-1表達(dá)情況
　　qRT-PCR通過(guò)TAKARA公司 SYBR?Premix Ex TaqII（Tli RNaseh Plus)系統(tǒng)完成。操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；BCA Protein assay測(cè)定蛋白濃度，將每份裂解的產(chǎn)物上樣、電泳、封閉后，分別

5、用一抗、二抗進(jìn)行孵育。運(yùn)用ECL發(fā)光液+膠片進(jìn)行顯色，β-actin作為蛋白質(zhì)內(nèi)參。
　?。?）CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況
　　應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖水平。設(shè)置空白對(duì)照孔，全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀（Bio-Rad730）測(cè)量OD490m光吸收值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　?。?）FACS（流式細(xì)胞儀）檢測(cè)分析細(xì)胞周期
　　經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化后，4°C預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，離心棄上清，70%無(wú)水乙醇吹散細(xì)胞團(tuán)

6、塊后4°C固定過(guò)夜，PI染料避光室溫孵育半小時(shí)。流式細(xì)胞儀（FACS Aria TMⅢ）進(jìn)行檢測(cè)。
　?。?）Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞加入transwell小室的上室中，而下室則加入10%胎牛血清的完全細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，加入4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.25%結(jié)晶紫染料染色15 min。
　?。?）SEM掃描電鏡觀察細(xì)胞微觀形態(tài)學(xué)狀態(tài)
　　

7、根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，將細(xì)胞稀釋至5x103/ml，接種1ml于細(xì)胞爬片，將爬片置于24孔板中，培養(yǎng)48h后，25%戊二醛固定30min，酒精（50%，75%，80%，90%，100%）梯度脫水，經(jīng)零點(diǎn)干燥儀處理后，爬片表面進(jìn)行噴砂導(dǎo)電，掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
　?。?）統(tǒng)計(jì)分析
　　檢測(cè)結(jié)果以（X±S）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用one-way ANOVA進(jìn)行分析，方差齊時(shí)使用L

8、SD法對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，若經(jīng)Levene檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)不滿足方差齊性，則采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。
　　結(jié)果:
　?。?）經(jīng)嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照細(xì)胞組內(nèi)LASP-1 mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯差別。但實(shí)驗(yàn)組SCC9細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降。
　?。?）經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別，shRNA-LASP-1-Lv實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)增殖生長(zhǎng)率

9、在2-6天均出現(xiàn)明顯抑制。
　?。?）LASP-1基因沉默可以阻滯細(xì)胞周期S期，SCC9陰性對(duì)照組21.68%±2.94%升高至實(shí)驗(yàn)組30.53%±2.85%（F=14.18，P＜0.05）；G2/M期從陰性對(duì)照組5.50%±0.71%下降到實(shí)驗(yàn)組3.50%±0.89%（F=5.29，P＜0.05）。而陰性對(duì)照組和空白細(xì)胞組G2/M和S沒(méi)有顯著差別。
　?。?）對(duì)細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜進(jìn)行計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組SCC9

10、均有多數(shù)細(xì)胞穿過(guò)，兩組間均無(wú)明顯差異。而實(shí)驗(yàn)組有較少細(xì)胞到達(dá)下室，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SEM電鏡下觀察細(xì)胞偽足，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞偽足相對(duì)減少。
　　結(jié)論:
　　（1）慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA-LASP-1-Lv可以顯著下調(diào)人口腔鱗癌細(xì)胞SCC9中LASP-1的mRNA和蛋白表達(dá)。
　?。?）LASP-1基因沉默誘導(dǎo)導(dǎo)致SCC9細(xì)胞增殖水平降低，并且使細(xì)胞周期阻滯在S期，導(dǎo)致G2/M期降低。
　?。?）低表達(dá)LASP-