Cofilin-1對人皮膚鱗癌A431細(xì)胞增殖和遷移能力的影響研究.pdf

1、目的:
　　本研究使用小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默cofilin-1基因的表達(dá),并觀察黃芩苷和cofilin-1沉默對人皮膚鱗癌A431細(xì)胞增殖生長和遷移能力的影響,以明確cofilin-1在皮膚鱗癌發(fā)生過程中的作用,并闡明黃芩苷抗皮膚腫瘤的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):用10％胎牛血清的高糖培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A

2、431細(xì)胞。
　　2、藥物配制:黃芩苷中加入二甲基亞砜(DMSO),配制成濃度為40mg/ml-20℃的冰箱冷藏備用,實驗時以培養(yǎng)基稀釋為50μg/ml。
　　3、siRNA干擾:針對cofilin-1 mRNA的序列設(shè)計合成了cofilin-1特異性的siRNA,并轉(zhuǎn)染人皮膚鱗癌A431細(xì)胞,運用實時定量PCR(Real-time PCR)法來檢測cofilin-1基因沉默的效果。
　　4、檢測細(xì)胞增殖活性:用細(xì)胞增

3、殖/毒性檢測試劑盒(CCK8)法檢測A431細(xì)胞的增殖的變化情況。
　　5、檢測細(xì)胞遷移能力:用細(xì)胞劃痕試驗檢測A431細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)果:
　　1.實時定量PCR結(jié)果表明,每個轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的cofilin-1 mRNA的相對的表達(dá)量都低于空白對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)的意義(P<0.05),表明cofilin-1 siRNA明顯抑制了cofilin-1表達(dá),在后繼實驗中,我們選擇沉默效果最好的siRNA片段進(jìn)行細(xì)

4、胞實驗,同時western blot檢測證實了CFL1-497-siRNA可在蛋白水平上有效抑制A431細(xì)胞中的cofilin-1的表達(dá)。
　　2.和空白對照組比較,cofilin-1 siRNA轉(zhuǎn)染于細(xì)胞24h、48h、72h之后,均出現(xiàn)細(xì)胞增殖活性明顯降低;單純加入黃芩苷孵育后,A431細(xì)胞增殖活性同樣出現(xiàn)不同程度下降;而當(dāng)把黃芩苷合并cofilin-1siRNA干擾時, A431細(xì)胞增殖活性的抑制作用最顯著,這表明沉默cof

5、ilin-1基因可顯著增強(qiáng)黃芩苷的作用;
　　3.細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示,劃痕后繼續(xù)培養(yǎng)24h,各組間細(xì)胞間隙均有一定程度愈合,其中黃芩苷組及cofilin-1siRNA組與對照組相比,劃痕愈合程度明顯下降;而黃芩苷合并cofilin-1-siRNA干預(yù)時,細(xì)胞的遷移愈合能力則進(jìn)一步下降,各組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)
　　結(jié)論:
　　抑制cofilin-1表達(dá)及單獨黃芩苷處理可明顯降低皮膚鱗癌細(xì)胞的活性與遷移