苦瓜皂苷雙水相分離純化及其降糖活性與構(gòu)效關(guān)系解析.pdf

1、苦瓜中的皂苷主要含有甾體類皂苷和三萜類皂苷，據(jù)報(bào)道其具有抗腫瘤、提高免疫、降血糖、抑菌、抗病毒等功能，尤其其降糖的功能活性受到較多的關(guān)注。雙水相系統(tǒng)具有溫和液相環(huán)境，能進(jìn)行連續(xù)分離操作；易于產(chǎn)業(yè)化和擴(kuò)大化等優(yōu)點(diǎn)，可用于混合物中萃取蛋白質(zhì)，多糖，皂苷及其它生物活性分子。大孔吸附樹脂，具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，又具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和很高的比表面積，在對皂苷粗提物的純化，除去水溶性多糖、色素等雜質(zhì)上顯出了獨(dú)特的效果，近年來在醫(yī)藥領(lǐng)域中廣為應(yīng)用。本

2、論文主要研究低分子醇/鹽雙水相萃取結(jié)合大孔樹脂層析分離純化具有高降糖活性的苦瓜皂苷，并對分離得到的苦瓜皂苷結(jié)構(gòu)特征與降糖活性之間的關(guān)系進(jìn)行解析與探討。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）對乙醇浸提苦瓜皂苷的條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。首先通過單因素（乙醇濃度、溫度和液料比）實(shí)驗(yàn)獲得最佳提取條件；然后根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置三因素三水平實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，得出響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果：乙醇濃度為66％，提取溫度為82℃，液料比為74:1時(shí)，最大得率Y=4.2

3、7%，進(jìn)一步對該優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證，獲得苦瓜皂苷得率為4.24%，與模型預(yù)測得率相差0.03%，這說明該響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)可以很好的應(yīng)用于苦瓜皂苷提取優(yōu)化。
　　（2）通過上述優(yōu)化后的浸提實(shí)驗(yàn)條件處理，獲得的苦瓜皂苷通過雙水相體系進(jìn)一步富集分離。首先，確定雙水相體系的相平衡數(shù)據(jù)，其次，考察雙水相體系類型（乙醇/(NH4)2SO4體系，異丙醇/(NH4)2SO4體系，PEG600/2000/(NH4)2SO4體系），系線長度（TLL

4、=25，30，35，40，45，50，83）和相比（R=0.4，0.8，1，1.2，2.5，3）對苦瓜皂苷分離純化性能的影響，采用香草醛-72%硫酸法測定兩相中的皂苷濃度，苯酚硫酸法測定多糖殘留，結(jié)果顯示，乙醇/(NH4)2SO4,異丙醇/(NH4)2SO4雙水相體系在苦瓜皂苷的富集和多糖的去除方面優(yōu)于其他體系，表明這兩種雙水相體系都可以用于苦瓜皂苷的分離提取。
　?。?）雙水相體系萃取是一個(gè)初級富集分離過程，為使苦瓜皂苷的純度和

5、降糖活性達(dá)到更高的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，本論文嘗試將雙水相體系結(jié)合大孔樹脂純化苦瓜皂苷，首先對大孔樹脂靜態(tài)吸附苦瓜皂苷的特性做了一些研究，考察時(shí)間、皂苷濃度、溫度、雙水相體系對大孔樹脂靜態(tài)吸附量的影響，結(jié)果表明，在8h時(shí)大孔樹脂對苦瓜皂苷可以達(dá)到趨近飽和的狀態(tài)，對皂苷的靜態(tài)飽和吸附量為250.312mg/g；溫度在0℃-40℃范圍內(nèi)時(shí)，隨著溫度的升高，吸附量在增大，但變化不明顯；乙醇濃度在0-60%范圍內(nèi)，PEG600濃度在0-30%范圍內(nèi)，(NH

6、4)2SO4濃度在0-1mol/L范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度、PEG600濃度的升高，吸附量在降低，隨著(NH4)2SO4濃度的升高，吸附量變化不明顯，初步判斷乙醇、PEG600不利于大孔樹脂對皂苷進(jìn)行吸附，(NH4)2SO4對其沒有影響。其次，大孔樹脂動態(tài)吸附和洗脫方面做了一些研究，首先使用傳統(tǒng)方法，單獨(dú)采用大孔樹脂層析技術(shù)純化皂苷，分離出六種不同極性的皂苷組分，研究發(fā)現(xiàn)極性較低的皂苷組分的降糖活性高，基于這個(gè)結(jié)果，希望借助雙水相體系富集純

7、化極性較低的組分，實(shí)驗(yàn)中將對大孔樹脂層析、乙醇/(NH4)2SO4體系結(jié)合大孔樹脂層析、異丙醇/(NH4)2SO4體系結(jié)合大孔樹脂層析技術(shù)分離純化苦瓜皂苷這三種方法做了比較研究，結(jié)果表明，乙醇/(NH4)2SO4體系、異丙醇/(NH4)2SO4體系結(jié)合大孔樹脂層析技術(shù)所得到的洗脫曲線的峰寬均窄于大孔樹脂分離方法，苦瓜皂苷得率（分別為15.1mg/g、8mg/g）均大于大孔樹脂分離方法（Y=5.65mg/g），且異丙醇/(NH4)2SO4

8、體系結(jié)合大孔樹脂層析技術(shù)分離純化的皂苷組分屬于極性較低的組分。
　?。?）把大孔樹脂層析、乙醇/(NH4)2SO4體系結(jié)合大孔樹脂層析、異丙醇/(NH4)2SO4體系結(jié)合大孔樹脂層析技術(shù)這三種方法所得的苦瓜皂苷進(jìn)行降糖活性比較、紅外光譜分析、高效液相檢測等。通過對α-葡萄糖苷酶抑制作用測定其降糖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇/(NH4)2SO4體系結(jié)合大孔樹脂層析、異丙醇/(NH4)2SO4體系結(jié)合大孔樹脂層析技術(shù)所得到的苦瓜皂苷對α-

9、葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度IC50分別為80μg/mL，50μg/mL，遠(yuǎn)低于單獨(dú)采用大孔樹脂分離方法得到皂苷的IC50（380μg/mL），說明前兩者具有更高的降糖活性。紅外光譜分析結(jié)果顯示，而后一種方法所得皂苷所含有的-CH3，-CHO數(shù)目大于前兩種，與文獻(xiàn)中已有的結(jié)構(gòu)式對照，初步判斷這三種方法所得皂苷為葫蘆烷型四環(huán)三萜皂苷，根據(jù)結(jié)構(gòu)顯示，后一種方法所得皂苷的極性小于前兩種，而且其含有醛基基團(tuán)，與之前的降糖活性分析相結(jié)合，推測其極性小