Nrf2重組慢病毒對細胞增殖、凋亡和分化的影響及小鼠ACLT骨關節(jié)炎模型的建立與鑒定.pdf

1、目的：構建轉錄因子NF-E2相關因子（NF-E2 related factor, Nrf2）重組慢病毒（lentivirus），靶向Nrf2和ATF4（activating transcription factor4）的siRNA重組慢病毒顆粒；探究Nrf2基因的重組慢病毒修飾對細胞向成骨細胞及軟骨骨細胞分化過程中增殖、凋亡和分化的影響；建立小鼠膝蓋前交叉韌帶切除術（ anterior cruciate ligament transec

2、tion, ACLT）的骨關節(jié)炎發(fā)病模型。
　　方法：將載有目的基因Nrf2序列的慢病毒骨架質粒pWPT-GFP-Nrf2與pMD2G、pSPAX2慢病毒包裝質粒共同轉染于293T細胞中，完成Nrf2慢病毒的包裝，同理設計并完成Lv-siNrf2和Lv-ATF4慢病毒的構建與包裝；在BMP2誘導C2C12細胞向成骨細胞分化的過程中，設立不同的病毒處理組，檢測Nrf2及ATF4對C2C12細胞增殖、凋亡及分化的影響；高密度微團培養(yǎng)C

3、3H10細胞，并在BMP2處理下誘導其向軟骨細胞分化，檢測Lv-Nrf2對C3H10向軟骨細胞分化過程中增殖和凋亡的影響，胎鼠腿骨組織體外培養(yǎng)，設立不同病毒處理組，腿組織包埋切片后，Tunel染色檢測胎鼠軟骨組織的凋亡情況，免疫組織化學法檢測凋亡相關蛋白在軟骨組織中的表達與分布；手術建立小鼠ACLT骨關節(jié)炎模型并對其進行評估鑒定。
　　結果：成功包裝了重組慢病毒Lv-Nrf2、Lv-siNrf2及Lv-siATF4（滴度約為1×1

4、08efu/mL）；BMP2誘導C2C12細胞向成骨細胞分化過程中，FCM的結果顯示，BMP2+Lv-Nrf2組細胞凋亡率低于BMP2+Lv-GFP組，BMP2+Lv-siNrf2組細胞凋亡率高于BMP2+Lv-GFP組， BMP2+Lv-Nrf2+Lv-siATF4組細胞凋亡率低于BMP2+Lv-GFP組并同時低于BMP2+ Lv-siATF4組；western結果與FCM凋亡結果一致；免疫細胞化學結果顯示，實驗組BMP2+Lv-Nr

5、f2組中骨鈣蛋白(Osteocalcin, OCN)與堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)表達增高，而BMP2+Lv-siNrf2組中兩種蛋白表達均降低，聯合處理組BMP2+Lv-Nrf2+Lv-siATF4中兩種蛋白表達低于對照組和BMP2+Lv-Nrf2組；在BMP2誘導微團培養(yǎng)的C3H10細胞向軟骨細胞分化過程中，FCM的結果顯示，與空病毒處理組相比，Lv-Nrf2組C3H10凋亡率下降，細胞中占S期的

6、細胞比例上升；western結果與FCM結果一致；Tunel細胞熒光染色結果顯示，與空病毒處理組相比，Lv-Nrf2處理組細胞凋亡率顯著下降；Tunel熒光及組織化學染色對胎鼠腿骨石蠟切片進行染色，結果顯示，與Lv-GFP處理組相比，Lv-Nrf2可以減少胎鼠腿骨組織中軟骨細胞凋亡的發(fā)生；成功在野生型小鼠和 PGRN缺陷型小鼠中建立ACLT骨關節(jié)炎模型；PGRN缺陷型小鼠比野生型小鼠 ACLT手術后，骨關節(jié)炎的癥狀更加嚴重。
　　

7、結論：一方面，在 BMP2誘導 C2C12細胞成骨分化過程中，Nrf2基因可抑制C2C12細胞的凋亡，促進其向成骨分化，同時，可挽回因ATF4蛋白減少而產生的細胞凋亡；另一方面，在 BMP2誘導微團培養(yǎng)的 C3H10細胞向軟骨細胞分化過程中，Nrf2可抑制C3H10細胞的凋亡并促進細胞的增殖，對軟骨組織的細胞具有一定保護作用；小鼠 ACLT模型在構建后8周時，關節(jié)炎的癥狀最為明顯，PGRN基因可能參與關節(jié)軟骨的損傷修復，可能參與骨關節(jié)炎