靜態(tài)牽張力作用下健康和牙周病微環(huán)境來源PDLSCs生物學(xué)功能及LncRNA表達(dá)譜的研究.pdf

1、正畸治療可以通過移動牙齒改善患者的外貌和笑容，在我國越來越多的成人患者開始尋求完善的正畸治療，但牙周病高發(fā)病率是成人正畸中無法忽視的問題。牙周病發(fā)病的主要臨床表現(xiàn)是慢性炎癥導(dǎo)致的牙周組織喪失、牙齒松動脫落，目前對牙周病的治療主要包括炎癥控制和牙周組織再生等方法。牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）因其高增殖分化能力和組織同源性被看作牙周再生中最重要的種子細(xì)胞之一。正畸牙齒移動時，P

2、DLSCs可以對力學(xué)刺激產(chǎn)生應(yīng)答，在牙周組織改建中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。研究表明，牙周炎微環(huán)境下PDLSCs的再生能力會受到損害，但其對力的反應(yīng)是否出現(xiàn)異常尚未可知。LncRNA已被證實在炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用，同時已有研究顯示健康牙周組織和牙周病牙周組織中存在大量差異表達(dá)的LncRNA，但LncRNA是否調(diào)控健康牙周組織來源的PDLSCs（PDLSCs obtained from healthy periodonta

3、l tissues, HPDLSCs）和牙周病組織來源的PDLSCs（PDLSCs obtained from periodontal tissues of periodontitis patients，PPDLSCs）對靜態(tài)牽張力（Static mechanical strain，SMS）的反應(yīng)還有待研究。因此針對上述問題，本課題進(jìn)行了兩部分研究：
　　第一部分HPDLSCs和PPDLSCs對不同級別SMS的反應(yīng)及最佳力值篩選研

4、究目的
　　1.分離培養(yǎng)HPDLSCs和PPDLSCs并鑒定其生物學(xué)特性
　　2.明確不同級別SMS對HPDLSCs和PPDLSCs增殖及成骨能力的影響
　　3.明確不同級別SMS對HPDLSCs和PPDLSCs破骨能力及炎癥反應(yīng)的影響
　　4.尋找促進(jìn)HPDLSCs和PPDLSCs再生能力的最佳SMS力值
　　研究方法：
　　1.采用低密度接種法分離培養(yǎng)HPDLSCs和PPDLSCs，流式細(xì)胞儀檢測

5、細(xì)胞表面間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，克隆形成能力檢測細(xì)胞增殖活性，茜素紅染色檢測細(xì)胞成骨能力；
　　2.使用Flexcell Tension Unit對HPDLSCs和PPDLSCs進(jìn)行6％、8%、10%、12%、14%的SMS加載；
　　3.在不同級別SMS加載后，使用流式細(xì)胞儀檢測HPDLSCs和PPDLSCs的細(xì)胞周期，MTT檢測HPDLSCs和PPDLSCs的細(xì)胞活性，ALP染色、ALP活性檢測、茜素紅染色、實時定量R

6、T-PCR檢測HPDLSCs和PPDLSCs的成骨能力；
　　4.在不同級別SMS加載后，實時定量RT-PCR檢測HPDLSCs和PPDLSCs中破骨基因Rankl和C-fos的表達(dá)，Elisa檢測HPDLSCs和PPDLSCs中炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的分泌情況。
　　實驗結(jié)果：
　　1.HPDLSCs和PPDLSCs均強(qiáng)陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物Stro-1、CD146、CD90和CD

7、29，陰性表達(dá)造血系標(biāo)記物CD31和CD14，同時，Stro-1、CD146、CD90和CD29在HPDLSCs中的表達(dá)比率均顯著高于在PPDLSCs。克隆形成能力檢測顯示HPDLSCs的克隆形成率為37%，PPDLSCs的克隆形成率為64%。茜素紅染色結(jié)果證實HPDLSCs和PPDLSCs均可以形成礦化結(jié)節(jié)，其中HPDLSCs形成的礦化結(jié)節(jié)較PPDLSCs多且面積大。
　　2.細(xì)胞周期和MTT實驗結(jié)果顯示，在未加力情況下，PPD

8、LSCs的增殖能力明顯高于HPDLSCs；而在牽張力加載后，從6%到14%的SMS對HPDLSCs的增殖能力均產(chǎn)生了促進(jìn)作用，其中12%的力值促進(jìn)作用最佳；對于PPDLSCs，只有6%和8%的SMS能夠促進(jìn)其增殖，其中8%的力值效果更優(yōu)；當(dāng)SMS大于8%時，PPDLSCs的增殖能力隨力值增加而顯著下降。ALP染色、ALP活性檢測、茜素紅染色和實時定量RT-PCR結(jié)果一致顯示，在未加力情況下，PPDLSCs的成骨能力低于 HPDLSCs，

9、而在 SMS加載后，HPDLSCs中各項成骨指標(biāo)均顯著上調(diào)，其中12%SMS對HPDLSCs的成骨作用促進(jìn)能力最強(qiáng)；而對于PPDLSCs，8%SMS能最大程度促進(jìn)其成骨能力，當(dāng)力值大于8%時，會對PPDLSCs的成骨能力產(chǎn)生明顯的抑制作用。
　　3.實時定量RT-PCR檢測加力組和對照組HPDLSCs及PPDLSCs中Rankl、C-fos的表達(dá)，結(jié)果顯示，在未加力情況下，PPDLSCs中Rankl和C-fos的表達(dá)水平明顯高于H

10、PDLSCs；而在牽張力加載后，當(dāng)力值低于12%時，HPDLSCs中Rankl和C-fos的表達(dá)水平較未加力時無明顯變化；當(dāng)力值大于12%時，Rankl和C-fos的表達(dá)顯著上調(diào)；在PPDLSCs組，當(dāng)力值低于8%時，Rankl和C-fos的表達(dá)無明顯變化，當(dāng)力值大于8%時，可明顯激活兩種破骨基因的表達(dá)。Elisa檢測結(jié)果顯示，PPDLSCs中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平均高于HPDLSCs；在SMS加載后，HP

11、DLSCs和PPDLSCs中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平略有升高，但不同力值對炎癥因子的表達(dá)無明顯差異，而在SMS加載后IL-6和IL-8的表達(dá)水平發(fā)生了大幅上調(diào)；在HPDLSCs組，當(dāng)力值低于12%時，加力組各組間IL-6和IL-8的表達(dá)水平無明顯差異，但當(dāng)力值高于12%時，IL-6和IL-8的表達(dá)水平顯著上升；而在PPDLSCs組，6%和8%的牽張力值對IL-6和IL-8的表達(dá)影響基本無區(qū)別，但當(dāng)力值大于8%，IL-6和IL-8

12、的表達(dá)會隨著力值的增大而逐漸增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1.HPDLSCs和PPDLSCs均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物，具有自我更新和多向分化潛能；但牙周病微環(huán)境刺激了 PPDLSCs的增殖能力、損害了其間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)率和成骨能力；
　　2.HPDLSCs和PPDLSCs對SMS的反應(yīng)不同，炎癥微環(huán)境使得PPDLSCs的力學(xué)敏感性增強(qiáng)，耐受性減弱；過大的靜態(tài)牽張力會導(dǎo)致 PPDLSCs的增殖能力降低，成骨破骨平衡被破壞，炎癥

13、反應(yīng)被激活；
　　3.從促進(jìn)牙周再生和組織改建的角度，施加于HPDLSCs的最佳SMS力值為12%，PPDLSCs的最佳SMS為8%。
　　第二部分12%SMS作用下HPDLSCs和PPDLSCs中LncRNA芯片表達(dá)譜研究研究目的
　　1.篩選12%SMS作用下HPDLSCs和PPDLSCs中差異表達(dá)的LncRNA
　　2.對HPDLSCs和PPDLSCs中LncRNA的差異表達(dá)情況及功能進(jìn)行分析
　　研

14、究方法：
　　1.12%SMS加載后，TRIzol提取HPDLSCs和PPDLSCs總RNA，RNasey Mini Kit對RNA進(jìn)行純化，分光光度計檢測對樣本RNA進(jìn)行質(zhì)檢及濃度測定，瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本完整性以及是否被gDNA污染，合成并純化cDNA后Nano Drop ND-1000檢測其質(zhì)量，NimbleGen Hybridization系統(tǒng)和NimbleGen wash buffer進(jìn)行芯片雜交洗滌，Axon Gen

15、e Pix4000B進(jìn)行芯片掃描，Nimble Scan software和Agilent Gene Spring GX software進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析。
　　2.利用KEGG生物學(xué)通路分析、GO分析、CNC分析對差異表達(dá)的LncRNA進(jìn)行功能分析
　　3.實時定量PCR驗證LncRNA芯片的可信度
　　實驗結(jié)果：
　　1.分光光度計檢測結(jié)果顯示，HPDLSCs和PPDLSCs樣本中提取的RNA吸光度值均在1.

16、8-2.1之間，接近2.0。瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示各樣本所提取RNA無gDNA污染，無明顯降解，可以用于后續(xù)芯片實驗。箱圖結(jié)果可見6個細(xì)胞樣本芯片熒光信號的強(qiáng)度一致，因此不會因信號不一致而導(dǎo)致結(jié)果不可靠。散點圖、火山圖、聚類圖直觀的顯示出HPDLSCs和PPDLSCs在牽張力加載后存在大量差異表達(dá)的LncRNA。
　　2.在12%SMS加載后變化倍數(shù)＞2且有統(tǒng)計學(xué)意義的LncRNA在 HPDLSCs中有8847種，PPDLSCs中

17、有9772種，在HPDLSCs和PPDLSCs中共同表達(dá)的LncRNA有7223種；而僅在HPDLSCs加力后發(fā)生變化的為1624種，其中表達(dá)倍數(shù)＞20倍的為27種（均為上調(diào)）；僅在PPDLSCs加力后表達(dá)發(fā)生變化的為2549種，其中表達(dá)倍數(shù)＞20倍的為16種（9種上調(diào)，7種下調(diào)）。
　　3.KEGG生物學(xué)通路分析顯示在HPDLSCs中差異表達(dá)的生物學(xué)通路包括脂肪酸降解通路、MAPK信號通路、血管平滑肌收縮通路、脂肪酸代謝通路、淀

18、粉和蔗糖代謝通路、葉酸碳庫通路、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路、礦化吸收通路、鈣離子信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路；而在 PPDLSCs中差異表達(dá)的生物學(xué)通路包括鞘脂類代謝通路、可卡因成癮通路、ErbB信號通路、亨廷頓氏舞蹈病通路、賴氨酸生物合成通路、B細(xì)胞受體信號通路、膀胱癌通路、同源重組通路、非小細(xì)胞肺癌通路、非酒精脂肪肝疾病通路。GO分析結(jié)果顯示在 HPDLSCs中差異表達(dá)的BP（biological process）條目有多個與力

19、學(xué)刺激和細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，例如response to stress、regulation of response to stimulus等；而在PPDLSCs中這些通路條目沒有出現(xiàn)。CNC分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)最為顯著的10個LncRNA能夠與相應(yīng) mRNA形成1250個共表達(dá)基因?qū)?，對這些共表達(dá)的mRNA進(jìn)行KEGG分析結(jié)果顯示其主要與 arginine and proline mtabolism、cell adhesion mol

20、ecules和leukocyte transendothelial migration通路有關(guān)。
　　4.實時定量RT-PCR顯示，隨機(jī)選取的四種 LncRNA（ TCONS_00008604、ENST00000428781、Uc004arq.1、ENST00000445814）表達(dá)情況與芯片結(jié)果趨勢一致。
　　結(jié)論：
　　1.本實驗收集的RNA樣本質(zhì)檢合格，可用于LncRNA芯片實驗；
　　2.12%SMS加載

21、條件下HPDLSCs和PPDLSCs中存在大量差異表達(dá)的LncRNA；
　　3.HPDLSCs中差異表達(dá)mRNA涉及的生物學(xué)通路大都為正常生物學(xué)反應(yīng)通路，而PPDLSCs中差異表達(dá)mRNA涉及的生物學(xué)通路多數(shù)與疾病相關(guān)；
　　4.在HPDLSCs中差異表達(dá)顯著的與力學(xué)刺激和細(xì)胞外信號傳導(dǎo)相關(guān)通路在PPDLSCs中未發(fā)生明顯變化，說明牙周炎微環(huán)境可能導(dǎo)致PPDLSCs對力學(xué)刺激的反應(yīng)出現(xiàn)異常；
　　5.實時定量RT-PC