缺血再灌注條件下IEC來源的BMP4和Il-7相互作用調(diào)節(jié)IEL凋亡研究.pdf

1、目的：
　　腸缺血再灌注損傷(ischemic/reperfusion，I/R)是在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、心肺功能不全、器官移植等的過程中常見組織器官損傷之一。腸粘膜屏障是一個復(fù)雜的屏障結(jié)構(gòu)，主要由機(jī)械屏障、免疫屏障、生物屏障、化學(xué)屏障等不同組分組成。其中由腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cell，IEC）和腸上皮間淋巴細(xì)胞(intestianl intr aepitheliallymphocytes，IEL)為

2、主組成的機(jī)械屏障和免疫屏障是決定腸屏障功能的核心因素。IEL作為一群主要由T淋巴細(xì)胞組成的特殊細(xì)胞群構(gòu)建的腸免疫屏障，IEC與IEL相互緊密，IEC可通過分泌的蛋白因子直接接觸作用于IELs，調(diào)控IEL的增殖、分化、凋亡等。因此深入研究探討IEC對IEL的調(diào)控機(jī)制，將有助于闡明應(yīng)激條件下腸粘膜屏障功能障礙的發(fā)病機(jī)制。
　　在腸道遭受到I/R損傷后，腸粘膜屏障在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、阻礙內(nèi)毒素轉(zhuǎn)移等功能受到限制，其中最主要的原因是腸上

3、皮細(xì)胞和腸上皮間淋巴細(xì)胞組成的機(jī)械屏障、免疫屏障受到極大破壞。前期研究發(fā)現(xiàn)小腸在胃腸外營養(yǎng)、缺氧、缺血再灌注刺激下腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)BMP4蛋白分泌表達(dá)增加，BMP4通過傳導(dǎo)下游信號可促進(jìn)促炎因子的釋放，進(jìn)一步加重腸黏膜屏障功能損傷。已有研究發(fā)現(xiàn)胸腺上皮細(xì)胞來源的BMP4可通過Smad信號影響前體細(xì)胞CD34+的成熟，進(jìn)而抑制胸腺內(nèi)T淋巴細(xì)胞的分化，使機(jī)體的免疫功能下降，而IL-7可以抵消BMP4對CD34+的影響。IELs作為腸道特殊免

4、疫淋巴細(xì)胞，在維持腸黏膜免疫屏障功能穩(wěn)定起重要作用。在TPN和I/R刺激下，IEL的功能降低、數(shù)量減少、凋亡增加使腸黏膜屏障功能障礙加重。為了進(jìn)一步研究在缺血再灌注下腸上皮細(xì)胞對腸上皮間淋巴細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。因此，本文擬通過體外實(shí)驗(yàn)檢測在缺血再灌注刺激下腸上皮細(xì)胞來源的BMP4和IL-7相互作用調(diào)節(jié)腸上皮間淋巴細(xì)胞凋亡的研究而展開的，為在缺血再灌注下IEC-IEL的對話機(jī)制研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.制作小鼠

5、腸I/R損傷模型，6小時后頸椎脫臼處死小鼠，取出小腸上段空腸組織制作石蠟切片和冰凍切片，HE染色觀察腸黏膜絨毛形態(tài)學(xué)變化，免疫熒光技術(shù)檢測腸上皮細(xì)胞內(nèi)BMP4、IL-7蛋白表達(dá)變化。
　　2.將小鼠頸椎脫臼處死，取全程小腸，提取小鼠腸IEL細(xì)胞，采用RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證IEL中存在BMP信號通路蛋白表達(dá)。
　　3.將小鼠缺血再灌注處理6小時后，提取腸上皮間淋巴細(xì)胞，用Sham作為對照組，用流式細(xì)胞術(shù)檢測在IEL中BM

6、P和IL-7信號通路蛋白表達(dá)變化。
　　4.將提取的IEL單獨(dú)培養(yǎng)，加入外源性BMP4、IL-7蛋白，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測IEL的凋亡率表達(dá)變化。
　　5.給予外源性IL-7蛋白刺激IEC-6、IEL后，Western-blot、流式技術(shù)檢測胞內(nèi)BMP4、p-NF-kB蛋白表達(dá)變化。
　　6.在IEC-6、IEL中給予外源性BMP4蛋白刺激后，Western-blot、流式技術(shù)檢測胞內(nèi)IL-7、IL-7R/CD127蛋白

7、表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.腸缺血再灌注處理6小時后，光鏡下發(fā)現(xiàn)腸黏膜部分絨毛斷裂、細(xì)胞脫落、部分結(jié)構(gòu)消失。同時，免疫熒光技術(shù)觀察到腸IEC內(nèi)BMP4蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，絨毛內(nèi)的IL-7蛋白表達(dá)明顯減少。
　　2.在IEL中通過RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)存在BMP經(jīng)典信號通路關(guān)鍵分子BMPRIA、BMPRIB、Smad1、Smad5、Smad8、p-NF-kB的表達(dá)，同時用流式技術(shù)驗(yàn)證IEL中存在BMPRIA、B

8、MPRIB、p-NF-kB的表達(dá)。
　　3.小鼠小腸在缺血再灌注條件下，IEL中BMPRIA、BMPRIB、P-Smad1/5、p-NF-kB表達(dá)量較Sham組明顯增高，同時IL-7R/CD127、P-STAT5表達(dá)明顯減少。
　　4.給予外源性BMP4刺激后，可誘導(dǎo)IEL的凋亡率增加。給予NOGGIN、PDTC、IL-7聯(lián)合刺激后，IEL中的IEL凋亡率與Control組無明顯差異。
　　5.在IL-7刺激下，IEC

9、中BMP4表達(dá)下調(diào)，IEL中BMP信號下調(diào)。
　　6.給予外源性BMP4刺激下，IEC-6中IL-7蛋白表達(dá)下調(diào)，在IEL中的IL-7R/CD127及P-STAT5蛋白表達(dá)減少.
　　結(jié)論：
　　1.在I/R損傷刺激下，腸黏膜部分絨毛斷裂、細(xì)胞脫落、結(jié)構(gòu)消失，腸屏障功能遭到極大破壞;腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)BMP4蛋白表達(dá)增加、IL-7表達(dá)減弱。
　　2.IEL中存在BMP信號通路表達(dá)，且在腸I/R損傷刺激下IEL內(nèi)BM