RNA結(jié)合蛋白Rbm47對B細(xì)胞Il-10產(chǎn)生和免疫調(diào)控作用的影響及機制的研究.pdf

1、B細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其主要功能為產(chǎn)生抗體、介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，同時還具備提呈抗原、分泌細(xì)胞因子的功能。長期以來，基于對B細(xì)胞經(jīng)典作用的認(rèn)識，人們一方面將其視為機體抵抗病原入侵并保持穩(wěn)態(tài)的主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，另一方面又將其異常活化視為多種免疫相關(guān)疾?。ㄌ貏e是自身免疫?。┑年P(guān)鍵致病因素。然而，在過去的二十多年中，人們逐漸發(fā)現(xiàn)一部分B細(xì)胞具有免疫負(fù)調(diào)控作用且對維持機體免疫平衡具有重要意義，根據(jù)其功能特征人們將這部分細(xì)胞稱之為調(diào)節(jié)性B

2、細(xì)胞(Breg，regulatory B cells)。
　　雖然大量的工作都已經(jīng)證實了Breg的存在，但人們對其表面標(biāo)志物和表型的界定并未達(dá)成一致觀點。在Breg具體的研究工作中，白細(xì)胞介素-10（IL-10，interleukin-10）的表達(dá)水平常被作為公認(rèn)指標(biāo)以對Breg進(jìn)行分析甚至分離。而在目前已發(fā)現(xiàn)的Breg的幾種功能相關(guān)分子中，IL-10是Breg發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵分子，對其研究也最為廣泛深入。一方面，體內(nèi)外的實驗均

3、表明IL-10缺失的Breg無法正常行使調(diào)節(jié)功能;另一方面，多項研究表明B細(xì)胞特異性的IL-10缺失會引發(fā)多種免疫相關(guān)疾病并與多種病理損傷相關(guān)。由于IL-10的表達(dá)與Breg的調(diào)節(jié)功能的緊密相關(guān)，研究B細(xì)胞中IL-10產(chǎn)生機制的對于深入認(rèn)識Breg具有重要的科學(xué)意義。
　　IL-10是免疫系統(tǒng)中經(jīng)典的抑炎因子，是調(diào)節(jié)機體免疫平衡的重要組分。IL-10可介導(dǎo)包括抑制天然免疫細(xì)胞的成熟與活化，抑制炎性細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)Treg分化等

4、在內(nèi)的多種免疫效應(yīng)，同時IL-10信號的缺失會導(dǎo)致多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生。外源性輸入的IL-10蛋白在體內(nèi)的代謝周期很短，限制了其作為藥物的臨床應(yīng)用，而利用內(nèi)源性的IL-10則能較好地解決這一問題。內(nèi)源性的IL-10可以來源于多種細(xì)胞，但近年來的多項研究表明B細(xì)胞是多種生理和病理狀態(tài)下IL-10的主要來源，而通過過繼回輸IL-10分泌的Breg細(xì)胞可以緩解和治療多種免疫相關(guān)疾病。因此對B細(xì)胞中IL-10產(chǎn)生機制的研究具有重要的應(yīng)用價值。

5、
　　IL-10的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平。長期以來，對Breg特異性轉(zhuǎn)錄因子的探索一直沒有停止但始終沒有結(jié)果，而已經(jīng)報道的能夠在B細(xì)胞中調(diào)控IL-10轉(zhuǎn)錄的幾種轉(zhuǎn)錄因子，如NF-kB，Bcl6和Blimp1等對B細(xì)胞多種其他生物學(xué)功能亦有影響，因此目前并沒有在B細(xì)胞中找到特異性調(diào)節(jié)IL-10表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。對IL-10轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平的研究表明，IL-10的mRNA的3，非翻譯區(qū)（3'UTR，3'-untransla

6、ted region）具有多個腺嘌呤和尿嘧啶富集序列(ARE，AU-rich element)，當(dāng)RNA結(jié)合蛋白或microRNA與之結(jié)合后會對IL-10 mRNA的穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著影響。因此，IL-10的最終蛋白表達(dá)水平會顯著地受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的影響，但目前對B細(xì)胞中IL-10表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究仍少有報道。
　　我們應(yīng)用IL-10抗體標(biāo)記磁珠分選了IL-10表達(dá)陽性和IL-10表達(dá)陰性的B細(xì)胞并通過基因芯片分析尋找IL-10表達(dá)相

7、關(guān)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。RBM47是我們篩選到的差異基因之一，其表達(dá)產(chǎn)物為一個具有3個RNA識別基序(RNArecognition motif)結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合蛋白。已有的研究表明Rbm47可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式影響mRNA分子的存在狀態(tài)并最終影響多種生物學(xué)進(jìn)程，但其對免疫系統(tǒng)的影響并未見報道。
　　通過基因改造和免疫治療相結(jié)合，T細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞都已在臨床上用于疾病的治療。Breg由于其獨特的免疫抑制功能也引起

8、了人們將其應(yīng)用于臨床治療的關(guān)注，而一些研究也探索了通過基因改造提高Breg免疫抑制效果的可行性，并得到了肯定的結(jié)論。由于IL-10是B細(xì)胞行使調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵分子，而IL-10的蛋白和mRNA都具有不穩(wěn)定性，因此我們假設(shè)通過找到并調(diào)控IL-10表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子可以促進(jìn)B細(xì)胞的調(diào)節(jié)性功能，并針對Rbm47這一分子進(jìn)行了驗證。
　　研究目標(biāo)
　　檢測IL-10+B細(xì)胞中Rbm47的表達(dá)情況;探討Rbm47對B細(xì)胞IL-10

9、產(chǎn)生及免疫抑制作用的影響及潛在機制;加深對Breg免疫調(diào)控作用形成機制的認(rèn)識并為推進(jìn)其臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。
　　方法與結(jié)果
　　1.應(yīng)用IL-10抗體標(biāo)記的磁珠，我們分選了IL-10分泌陽性和IL-10分泌陰性的B細(xì)胞，并應(yīng)用表達(dá)譜芯片技術(shù)分析差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)蛋白，RBM47在IL-10分泌陽性的B細(xì)胞中表達(dá)顯著升高。
　　2.通過應(yīng)用LPS體外誘導(dǎo)IL-10和及應(yīng)用IL-10-GFP報告基因小鼠分選IL

10、-10分泌陽性和IL-10分泌陰性細(xì)胞，我們對基因芯片的結(jié)果進(jìn)行了驗證。結(jié)果表明，B細(xì)胞中的Rbm47在IL-10誘導(dǎo)過程中表達(dá)升高，且特異性表達(dá)在IL-10分泌陽性的B細(xì)胞中。
　　3.通過干擾慢病毒感染和嘌呤霉素篩選，我們建立了Rbm47敲低的SP2/0細(xì)胞系。通過應(yīng)用qPCR和ELISA對其IL-10表達(dá)水平的檢測，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比Rbm47敲低的SP2/0細(xì)胞系中IL-10的mRNA和蛋白表達(dá)水平都有顯著下降。

11、　　4.通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚏NA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP，RNA BindingProtein Immunoprecipitation)實驗我們檢測了Rbm47對IL-10啟動子和mRNA的結(jié)合水平。結(jié)果表明Rbm47可結(jié)合IL-10的mRNA而不結(jié)合IL-10的啟動子。
　　5.通過應(yīng)用放線菌素D抑制mRNA合成，并在不同時間點收集mRNA樣品以測定IL-10mRNA的衰減速率，我們分析了Rbm47對IL-10mRNA

12、穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，敲低Rbm47后B細(xì)胞中IL-10的降解速率顯著加快，而在過表達(dá)Rbm47的體系中IL-10的降解速率則被減緩。
　　6.通過應(yīng)用Rbm47過表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代B細(xì)胞，我們進(jìn)一步分析了Rbm47對B細(xì)胞中IL-10表達(dá)的影響。qPCR和FACS的結(jié)果都表明Rbm47過表達(dá)可以促進(jìn)B細(xì)胞中IL-10的表達(dá)。
　　7.通過流式分選Rbm47表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的B細(xì)胞及對照細(xì)胞并將其與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，

13、我們在體外分析了Rbm47對B細(xì)胞調(diào)節(jié)性功能的影響。結(jié)果表明，Rbm47過表達(dá)可以促進(jìn)B細(xì)胞分泌IL-10并促進(jìn)Treg的誘導(dǎo)分化。
　　8.通過給IL-10-GFP報告基因小鼠飼喂?jié)舛葹?％的DSS進(jìn)行潰瘍性結(jié)腸炎(UC，ulcerative colitis)造模，我們檢測了其腸系膜淋巴結(jié)中IL-10表達(dá)陽性B細(xì)胞的豐度及腸系膜淋巴結(jié)B細(xì)胞中IL-10和Rbm47表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正常小鼠相比，UC小鼠腸系膜淋巴結(jié)中IL-1

14、0分泌B細(xì)胞的比例減少，同時其腸系膜淋巴結(jié)B細(xì)胞中IL-10和Rbm47的表達(dá)水平降低。
　　9.通過過繼轉(zhuǎn)移Rbm47表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的B細(xì)胞及對照B細(xì)胞對DSS誘導(dǎo)UC小鼠進(jìn)行治療，我們在體內(nèi)評價了Rbm47對B細(xì)胞調(diào)節(jié)性功能的影響。結(jié)果表明，與對照組相比Rbm47過表達(dá)B細(xì)胞可減緩UC小鼠體重降低，減輕腸道損傷并增加腸系膜淋巴結(jié)中Treg的比例，緩解UC小鼠的疾病的嚴(yán)重程度。
　　結(jié)論：
　　綜上，本研究表明R