人源化乳腺癌耐藥蛋白高表達BCRp-MDCKII細胞模型的建立IMMH002(H002)臨床前藥代動力學研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述
　?、袢嗽椿橄侔┠退幍鞍赘弑磉_BCRP-MDCKⅡ細胞模型的建立
　　乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein, BCRP）的分子量約為72 kDa，屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族。BCRP通過利用ATP水解釋放的能量，將細胞內(nèi)的有毒物質(zhì)或者藥物通過胃腸道、膽汁和尿液排出體外，發(fā)揮其抵抗外來毒性物質(zhì)侵襲的作用。本研究應(yīng)用慢病毒感染MDCKⅡ細胞的方法建立人源

2、化BCRP高表達BCRP-MDCKⅡ細胞模型。結(jié)果表明:
　　1.酶切實驗和DNA測序結(jié)果表明，攜帶目的基因ABCG2表達質(zhì)粒pSIN4-EF2-ABCG2-IRES-Neo的菌種可在Soc培養(yǎng)基中正確擴增和富集。
　　2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法介導pSIN4-EF2-ABCG2-IRES-Neo質(zhì)粒進入病毒包裝細胞HEK-293T，經(jīng)G418篩選后，可得到含有目的基因BCRP的慢病毒。病毒滴度經(jīng)測定為5×104 pfu/mL。

3、>　　3.慢病毒感染MDCKⅡ細胞，經(jīng)G418篩選后，可得到人源化高表達BCRP-MDCKⅡ細胞模型。RT-PCR和western blot結(jié)果表明，BCRP-MDCKⅡ細胞株可穩(wěn)定高表達外源基因ABCG2。
　　ⅡH002臨床前藥代動力學研究
　　H002是一種新型鞘氨醇-1-磷酸受體1（Sphingosine1-phosphate receptorsubtype1，S1PR1）激動劑。與傳統(tǒng)免疫抑制劑（如糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢

4、素A、他克莫司等）的作用機制不同，H002在體內(nèi)可逆地生成其活性形式—磷酸化產(chǎn)物H002-P，通過與S1PR1結(jié)合使其發(fā)生內(nèi)陷，誘導淋巴細胞“歸巢”，抑制淋巴細胞自外周淋巴結(jié)及次級淋巴器官的外流，從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用。前期藥理研究表明，H002對類風濕性關(guān)節(jié)炎、實驗性銀屑病等免疫性疾病動物模型均有較好的藥效。此外，H002誘導的外周血淋巴細胞數(shù)降低可在停藥后短時間內(nèi)恢復至正常水平，對機體正常免疫功能的影響較小。
　　本研究根據(jù)臨床

5、前藥代動力學指導原則，建立了生物樣品中H002及其代謝產(chǎn)物的LC-MS/MS分析方法，應(yīng)用已建立的LC-MS/MS方法研究了大鼠和Beagle犬口服和靜脈注射H002后的全血藥代動力學、分布（大鼠）和排泄特征;鑒定了H002生物轉(zhuǎn)化的主要場所和參與代謝的主要藥酶類型;研究了H002與大鼠、犬、猴、人的血漿蛋白結(jié)合及其對CYP450s和UDPGT活性的影響，為揭示藥物在體內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律及種屬差異，闡明藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，了解藥物在體內(nèi)代

6、謝、排泄特點以及預測潛在的藥物相互作用提供試驗依據(jù)。研究結(jié)果表明:
　　1.生物樣品中H002及其代謝產(chǎn)物測定方法(LC-MS/MS)的建立
　　大鼠全血基質(zhì)中，H002及其磷酸化產(chǎn)物H002-P、羥化產(chǎn)物H002-M分別在0.2-100 ng/mL、0.25-100 ng/mL和0.2-100 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，未見明顯基質(zhì)和雜質(zhì)干擾。H002、H002-P和H002-M質(zhì)控樣品(濃度分別為0.5、25、8

7、0 ng/mL，1.5、25、80 ng/mL，0.5、25、80 ng/mL，)的日內(nèi)和日間精密度相對標準差均小于11.76％，準確度為±9.84％。
　　2.H002在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究
　　(1)大鼠口服H002后的全血藥代動力學
　　雌雄大鼠口服H002(1、3、10、30 mg/kg)后5min血中可檢測到H002、H002-P和H002-M，給藥后72-144h各組動物血藥濃度低于或接近檢測限。

8、>　　雌雄大鼠口服H002后，H002、H002-P和H002-M的Cmax和AUC(0-t)隨劑量增加而遞增，在1-30 mg/kg劑量范圍內(nèi)原型藥、H002-P和H002-M在體內(nèi)基本呈線性動力學過程，高劑量組t1/2和MRT(0-t)隨劑量增加略有延長。
　　(2)大鼠靜脈注射H002后的全血藥代動力學
　　雌雄大鼠靜脈注射H002后2min血中可檢測到原型藥及代謝物H002-P和H002-M，給藥后48h各組動物血藥

9、濃度低于或接近檢測限。
　　(3)大鼠口服H002后在體內(nèi)主要組織的分布
　　大鼠口服H002(1 mg/kg)后原型藥和代謝物在體內(nèi)分布廣泛。雄鼠給藥后0.5 h組織和器官中原型藥濃度排序為:胃＞小腸＞淋巴結(jié)＞腎上腺＞肺＞肝臟＞腎＞骨髓＞脂肪＞脾＞肌肉＞附睪＞心臟＞胸腺＞睪丸＞全血，腦中藥物濃度低于最低定量限。雌鼠給藥后0.5 h組織和器官中原型藥濃度排序為:淋巴結(jié)＞胃＞小腸＞腎上腺＞肺＞子宮＞心臟＞卵巢＞肝臟＞腎＞骨髓＞

10、脂肪＞脾＞肌肉＞胸腺＞腦＞全血。雌雄給藥后4h、18h的分布趨勢與0.5 h相似。H002-P和H002-M在各組織中的分布趨勢和原型藥相似。
　　(4)大鼠口服H002后自糞、尿、膽汁中的排泄
　　雌雄大鼠口服H002后在糞、尿、膽汁中均可檢測到原型藥、H002-P、H002-M和羥化產(chǎn)物的硫酸結(jié)合物(H002-OSO3)。
　　雄雌大鼠口服H002(1 mg/kg)后原型藥和代謝物糞、尿總排泄量分別為給藥量的57.

11、01％和42.95％，主要經(jīng)糞便途徑。
　　(5) H002與大鼠、犬、猴和人的血漿蛋白的結(jié)合
　　H002(30、300和1500 ng/mL)與大鼠、犬、猴和人的血漿蛋白結(jié)合率為98.13-99.17％，提示H002與血漿蛋白高度結(jié)合，各種屬間無明顯差異，也未見明顯濃度依賴性。
　　3.H002在Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學研究
　　(1) Beagle犬口服H002后的全血藥代動力學
　　Beagl

12、e犬口服H0020.3、1.8、10 mg/kg后5-30 min血中可檢測到原型藥、H002-P和H002-M(0.3mg/kg劑量組多數(shù)時間點H002-M的濃度均低于最低定量限)，血藥濃度呈多峰現(xiàn)象，給藥后384-1248 h各組動物血藥濃度低于或接近檢測限。
　　雌雄Beagle犬口服H002后，原型藥和代謝物的Cmax和AUC(0-t)隨給藥劑量增加而遞增，在0.3～10 mg/kg劑量范圍內(nèi)原型藥及代謝物在體內(nèi)基本呈線性

13、動力學過程，高劑量組t1/2和MRT(0-t)隨劑量增加略有延長。
　　(2) Beagle犬靜脈注射H002后的全血藥代動力學
　　雌雄Beagle犬靜脈注射H002(0.1 mg/kg)后2min血中可檢測到原型藥和代謝物H002-P，多數(shù)時間點血樣中代謝物H002-M的含量低于最低定量限(0.5ng/ml)。原型藥和H002-P的血藥濃度于給藥后22 d和16d低于或接近檢測限。
　　(3) Beagle犬多次口

14、服H002后的全血藥代動力學
　　Beagle犬連續(xù)口服H002(1.8 mg/kg)12天后血藥濃度達到穩(wěn)態(tài)，末次給藥后雌雄犬血中原型藥、H002-P和H002-M的藥代動力學參數(shù)未見明顯性別差異。與單次給藥相比，末次給藥后(24 h)原型藥和代謝物的Gmax和AUC(0-t)均明顯增加。
　　(4) Beagle犬口服H002后自糞、尿中的排泄
　　Beagle犬口服H002后糞、尿中均可檢測到原型藥、H002-P

15、、H002-M及H002-OSO3。
　　4.H002的生物轉(zhuǎn)化研究
　　大鼠、Beagle犬口服H002后在血、糞、尿、膽汁中可檢測到多個代謝產(chǎn)物，包括磷酸化產(chǎn)物(H002-P)、羥化產(chǎn)物(H002-M)、羥化產(chǎn)物的硫酸結(jié)合物(H002-OSO3)。H002與大鼠/人伏/猴肝微粒體體外溫孵后也可檢測到代謝物H002-P和H002-M，體內(nèi)外代謝產(chǎn)物具有一定的相關(guān)性，而H002-OSO3主要在體內(nèi)生成。
　　體外代謝穩(wěn)

16、定性研究結(jié)果表明，H002(10μ M)與人工胃液、人工腸液、腸道菌群及大鼠血漿溫孵6h后未見明顯減少。與大鼠、犬、猴、人全血溫孵6h后H002-P的生成量隨溫孵時間延長逐漸增加，提示全血可能是H002-P生成的主要場所。
　　H002與大鼠不同組織勻漿溫孵后，H002-P的生成量依次排序為血＞肝臟＞脾臟＞腦＞胃＞淋巴結(jié)＞心臟＞腎＞肺＞小腸＞胸腺，H002-M生成量的排序為肝臟＞小腸＞肺＞脾＞淋巴結(jié)＞腎＞腦＞胸腺＞心臟＞胃，進一步

17、提示H002-P生成的主要場所為全血，H002-M生成的主要場所為肝臟和小腸。
　　5.H002及其代謝產(chǎn)物對藥物代謝酶的抑制/誘導作用
　　H002體外(1-10μM)對大鼠/人/犬/猴肝微粒體中的CYP1A2、CYP2C19、CYP4F2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2J2、CYP2E1的抑制作用為20.16％-40.33％。
　　6.H002在Caco-2和MDR1-MDCKⅡ細胞中的轉(zhuǎn)運
　　H00