LYRM1基因沉默致心肌樣細(xì)胞凋亡的線粒體機(jī)制研究.pdf

1、心臟發(fā)育的過(guò)程是極其復(fù)雜的，涉及不同時(shí)間和空間的一系列胚胎發(fā)育相關(guān)基因的順序表達(dá)。心臟結(jié)構(gòu)和功能對(duì)心臟發(fā)育相關(guān)基因的擾動(dòng)相當(dāng)敏感。在心臟發(fā)育相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)中，任何一個(gè)基因突變都可能導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。因此，先天性心臟病遺傳學(xué)病因的探索仍然是預(yù)防和治療該病的關(guān)鍵。
　　LYRM1(LYR motif containing1)基因是郭錫熔教授課題組發(fā)現(xiàn)并克隆得到的一條人類新基因。令人驚訝的是，多組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)LYRM1基因除了在

2、人類脂肪組織中高豐度表達(dá)外，在心臟組織中同樣呈現(xiàn)高豐度表達(dá)。另外，研究表明LYRM1是LYR超家族復(fù)合體1的成員，而LYR蛋白主要是線粒體蛋白質(zhì)，影響線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。郭錫熔教授課題小組成員發(fā)現(xiàn)LYRM1在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的增值、凋亡及分化過(guò)程均扮演重要角色，且具有損傷3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞線粒體功能作用。鑒于心臟和脂肪均來(lái)源于中胚層，來(lái)源于相同胚層的組織具有相似的結(jié)構(gòu)與功能，因此提示LYRM1也可能參與心臟發(fā)生發(fā)育的生理過(guò)程。本

3、研究小組探索了LYRM1基因過(guò)表達(dá)在P19細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化過(guò)程的作用，結(jié)果顯示LYRM1基因過(guò)表達(dá)雖然不影響P19細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞的分化，但是能顯著誘導(dǎo)P19細(xì)胞的增殖、明顯抑制P19細(xì)胞凋亡。因此，我們推測(cè)LYRM1基因在心臟發(fā)育中可能占有重要作用。
　　為進(jìn)一步探討心臟發(fā)育過(guò)程中LYRM1基因的功能角色，我們選擇P19細(xì)胞作為研究對(duì)象，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)使LYRM1基因表達(dá)沉默，進(jìn)而探索LYRM1基因表達(dá)沉默對(duì)P19細(xì)胞增

4、殖、凋亡和分化的影響，以及對(duì)P19誘導(dǎo)分化的心肌樣細(xì)胞線粒體功能的影響。深度分析LYRM1基因?qū)π募蛹?xì)胞凋亡的影響及凋亡作用與線粒體功能之間的關(guān)系，進(jìn)一步論證在胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中LYRM1基因的重要作用及致畸的可能機(jī)制，這將為先天性心臟病的病理生理學(xué)的基礎(chǔ)研究提供新線索。
　　第一部分 LYRM1基因表達(dá)沉默對(duì)P19細(xì)胞增殖凋亡及分化的影響
　　目的:探索LYRM1基因表達(dá)沉默對(duì)P19細(xì)胞增殖、凋亡及分化的影響。
　

5、　方法:設(shè)計(jì)LYRM1干擾靶序列，構(gòu)建LYRM1基因短發(fā)夾狀RNA的慢病毒載體pgLV-U6-puro-LYRM1-shRNA，對(duì)照組為pgLV-U6-puro-NC-shRNA。將pgLV-U6-puro-LYRM1-shRNA或pgLV-U6-puro-NC-shRNA轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞并獲得病毒上清，感染P19細(xì)胞并用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的P19細(xì)胞。定量PCR檢測(cè)LYRM1基因沉默干擾效果;細(xì)胞計(jì)數(shù)盒(CCK-8)檢

6、測(cè)其對(duì)P19細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、分析Caspase-3的活性及檢測(cè)細(xì)胞凋亡;倒置顯微鏡觀察P19細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的改變;定量PCR及Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞分化過(guò)程中的心肌標(biāo)志物基因(GATA4和Nkx2-5)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1）LYRM1基因沉默明顯抑制P19細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為:促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入G1期，受阻于S期;2)LYRM1基因沉默顯著促進(jìn)P19細(xì)胞凋亡;3）沉默LYRM1

7、基因的P19細(xì)胞分化過(guò)程中，細(xì)胞邊緣模糊，不規(guī)整。心肌標(biāo)志物GATA4和Nkx2-5的基因表達(dá)水平均在心肌細(xì)胞分化第6天和第10天顯著下降，蛋白表達(dá)水平在分化第6天前均無(wú)明顯變化，但第10天明顯下降。
　　結(jié)論: LYRM1基因表達(dá)沉默具有抑制P19細(xì)胞的增值、促進(jìn)其凋亡以及抑制P19細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的作用，提示LYRM1基因在胚胎心臟發(fā)育過(guò)程可能占有重要作用。
　　第二部分 LYRM1基因表達(dá)沉默對(duì)P19細(xì)胞誘導(dǎo)分化的

8、心肌樣細(xì)胞線粒體功能的影響
　　目的:探討LYRM1基因表達(dá)沉默對(duì)P19細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心肌樣細(xì)胞線粒體功能的影響。
　　方法:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LYRM1基因沉默病毒的P19細(xì)胞株，經(jīng)1％DMSO誘導(dǎo)分化成為心肌樣細(xì)胞。以誘導(dǎo)分化第10天的心肌樣細(xì)胞為研究對(duì)象，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)線粒體DNA拷貝數(shù);ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞ATP含量;采用DCFDA(2，7-Dichlorofluorescein diacetate，DCFDA

9、)熒光探針、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的改變;應(yīng)用JC-1（Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1）熒光探針、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位的變化。
　　結(jié)果:1）LYRM1基因沉默對(duì)心肌樣細(xì)胞的線粒體DNA拷貝數(shù)無(wú)明顯影響;2) LYRM1基因沉默的心肌樣細(xì)胞中ATP含量顯著降低;3）LY