基于“組分結(jié)構(gòu)”特征的參芍舒胸方制劑設(shè)計(jì)前“芎芍”組分ADME-Eff性質(zhì)研究.pdf

1、中藥制劑不同于傳統(tǒng)化學(xué)藥物制劑，其制劑前處理過(guò)程是影響中藥成藥性及藥效的關(guān)鍵因素，“中藥物質(zhì)基礎(chǔ)—整體藥效—組分結(jié)構(gòu)—制劑前性質(zhì)”內(nèi)在存在特殊關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)中藥組分（有限“N”個(gè)代表性成分）的化學(xué)成分普適性，確定思路及建立中藥組分ADME/Eff性質(zhì)表征方法，中藥制劑前處理中對(duì)組分結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及組分ADME/Eff性質(zhì)表征對(duì)于中藥組分制劑的發(fā)展有著至關(guān)重要的作用。中藥“藥對(duì)”在中醫(yī)辨證施治的過(guò)程中具有優(yōu)化藥物組合的功效，能起到協(xié)同藥效，并相互

2、糾正其偏性，緩和其毒性達(dá)到相輔相成的效果，藥對(duì)介于中藥復(fù)方與單味藥之間，是獨(dú)具特色的中醫(yī)臨床用藥，在中醫(yī)方劑配伍中占有重要地位。中藥功效物質(zhì)基礎(chǔ)組成是個(gè)復(fù)雜的整體，其內(nèi)在的化學(xué)成分/組分之間存在的獨(dú)特“結(jié)構(gòu)”特征，這種組成結(jié)構(gòu)特征的差別是造成藥效差異的根本原因?！八帉?duì)”的巧妙配伍，改變了物質(zhì)基礎(chǔ)組成結(jié)構(gòu)，糾正其偏性。物質(zhì)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)必然對(duì)藥物體內(nèi)的生物藥劑學(xué)過(guò)程產(chǎn)生影響。因此，闡明組分結(jié)構(gòu)改變對(duì)藥效以及藥動(dòng)學(xué)的改變的影響，是科學(xué)闡述“藥對(duì)”

3、用藥科學(xué)內(nèi)涵的前提，也為創(chuàng)新組分結(jié)構(gòu)中藥的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　赤芍和川芎為臨床常用的活血化瘀藥，但目前對(duì)赤芍和川芎藥對(duì)配伍的深入研究比較少，藥對(duì)的配伍究其本質(zhì)實(shí)際是組分間結(jié)構(gòu)的改變?！敖M分結(jié)構(gòu)理論”認(rèn)為，中藥（復(fù)方）及藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)即由不同組分構(gòu)成按一定的量比關(guān)系（結(jié)構(gòu)）組成，穩(wěn)定的組分結(jié)構(gòu)決定著療效的可重復(fù)性。本課題基于中醫(yī)藥“藥對(duì)”理論及物質(zhì)基礎(chǔ)“組分結(jié)構(gòu)理論”，通過(guò)對(duì)藥對(duì)協(xié)同作用的驗(yàn)證，結(jié)合體外Caco-2模型及入血成分

4、辨識(shí)快速篩選出“川芎-赤芍”藥對(duì)中的主要作用組分，并對(duì)其組分結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，研究其優(yōu)化前后藥效與ADME/Eff過(guò)程的變化，為闡明藥對(duì)的科學(xué)內(nèi)涵提供新的思路和方法，也將推動(dòng)中藥制劑前處理研究的進(jìn)展，從而為中藥組分制劑的研究提供理論依據(jù)。主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)部分:
　　1.組分結(jié)構(gòu)理論下芎芍藥對(duì)抗缺血制劑合理性考察
　　本部分內(nèi)容采用大鼠線栓法制備大腦中動(dòng)脈梗塞(MCAO)模型，研究川芎、赤芍及其藥對(duì)對(duì)缺血性大鼠腦組織的保護(hù)作用

5、，并進(jìn)一步探討其可能作用機(jī)制。結(jié)果顯示，相比單獨(dú)使用川芎或赤芍藥味，芎芍藥對(duì)保護(hù)腦缺血損傷的功效更強(qiáng)，即可顯著減輕腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損、減少腦梗死面積;改善氧化指標(biāo):升高SOD、CAT，降低MDA含量、LPO活性;升高血漿PA含量，降低PAI-1含量，提高VEGF、GRP78表達(dá)，降低p-p38MPAK、TLR-4、 TLR-5、NFkBp65、PERK、XBP-1、CHOP、Caspase-3和Caspase-12表達(dá);增加海馬神經(jīng)

6、元相關(guān)蛋白Akt、P-CREB表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡，保護(hù)血腦屏障，降低ERK蛋白的磷酸化程度，下調(diào)TLR4、p-p38和NF-kBp65蛋白;降低NMDAR1 mRNA表達(dá)及增加VEGF mRNA的表達(dá);降低了伊文氏藍(lán)(EB)的含量，改善血腦屏障通透性。這部分結(jié)果表明芎芍藥對(duì)對(duì)腦缺血大鼠的治療效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用，提示芎芍藥對(duì)具有功效協(xié)同作用，也證明芎芍抗腦缺血制劑生產(chǎn)的合理性。
　　2.制劑基本單元的組分/成分的表征、辨析

7、r>　　在前部分藥效評(píng)估基礎(chǔ)上，需要進(jìn)一步揭示藥對(duì)配伍后入血成分。本部分內(nèi)容利用Caco-2單層模型對(duì)芎芍藥對(duì)腸吸收的活性及機(jī)制進(jìn)行研究，為其體內(nèi)過(guò)程的研究提供基礎(chǔ)。川芎、赤芍提取液以藥對(duì)形式合用時(shí)，能促進(jìn)赤芍總苷組分的單層滲透，同時(shí)提高其透過(guò)率。LC/ESI/MS/MS技術(shù)尋找、辨別和歸屬穿透Caco-2活性成分，綜合分析化合物的保留時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量、碎片離子信息，鑒定出8個(gè)主要成分，分別為原兒茶酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、

8、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酰芍藥苷。血清化學(xué)結(jié)合UPLC/Q-TOF-MS對(duì)芎芍藥對(duì)入血成分進(jìn)行鑒定，以明確其進(jìn)入血液發(fā)揮藥效作用的組分，赤芍中四個(gè)苷類(lèi)成分:氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷;川芎中四個(gè)酚酸類(lèi)成分:原兒茶酸、兒茶素、咖啡酸、阿魏酸。本部分研究初步認(rèn)定赤芍總苷和川芎總酚酸為芎芍藥對(duì)的抗腦缺血的活性組分。
　　3.川芎、赤芍中抗腦缺血組分制備及結(jié)構(gòu)優(yōu)化
　　赤芍總苷和川芎總酚酸為入血組分，但其發(fā)揮功

9、效的最佳量比關(guān)系是如何的呢？本部分研究首先制備獲得組分:通過(guò)對(duì)赤芍總苷、川芎總酚酸組分共同采取現(xiàn)代分離、分析技術(shù)，進(jìn)行分離富集，獲得組分。采用正交設(shè)計(jì)選出最佳提取工藝，比較5種大孔樹(shù)脂的吸附、解吸附性能，篩選出D101型大孔樹(shù)脂用于赤芍總苷分離純化，AB-8型大孔樹(shù)脂用于川芎總酚酸分離純化。最終獲得的赤芍總苷和川芎總酚酸的含量分別為47.92％、41.43％。其次，采用腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞OGD模型對(duì)川芎總酚酸組分和赤芍總苷組分不同組分間結(jié)

10、構(gòu)的體外抗腦缺血活性進(jìn)行優(yōu)化篩選，通過(guò)相關(guān)生化因子的測(cè)定，結(jié)果表明，芎芍組分結(jié)構(gòu)在7∶3時(shí)，減輕氧化損傷(SOD、MDA、NO和NOS)的能力最強(qiáng)，降低炎癥因子TNF-α、IL-6、sICAM-1表達(dá)最明顯。最后，應(yīng)用大鼠腦缺血模型對(duì)體外模型篩選出的芎芍組分最佳結(jié)構(gòu)進(jìn)行藥效驗(yàn)證。與芎芍組分結(jié)構(gòu)未進(jìn)行優(yōu)化相比，芎芍7∶3組分結(jié)構(gòu)比例對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損的保護(hù)效果最佳，能明顯降低腦缺血大鼠腦梗死面積，抗自由基氧化，顯著降低MMP-9表達(dá)，升高

11、血漿PA含量，降低PAI-1含量。保護(hù)大鼠腦內(nèi)血腦屏障，通過(guò)TEM、WB、Q-PCR、TUNEL等技術(shù)檢查腦缺血大鼠腦內(nèi)細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果表明，芎芍7∶3組分結(jié)構(gòu)組對(duì)腦細(xì)胞抗凋亡能力最強(qiáng)。本部分研究表明，芎芍組分結(jié)構(gòu)為7∶3時(shí)，其對(duì)腦缺血的治療效果最優(yōu)。
　　4.芎芍組分結(jié)構(gòu)優(yōu)化前后生物利用度、腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及組分腦組織分布評(píng)價(jià)
　　最優(yōu)的組分結(jié)構(gòu)是否能提高組分/成分的體內(nèi)生物利用度呢？本部分開(kāi)展該項(xiàng)研究。借助HPLC/MS/

12、MS技術(shù)分析比較大鼠灌胃赤芍總苷組分、川芎總酚酸組分、芎芍組分結(jié)構(gòu)為7∶3時(shí)在大鼠體內(nèi)原兒茶酸、兒茶素、阿魏酸、咖啡酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的藥動(dòng)學(xué)特征，并進(jìn)行整合藥代動(dòng)力學(xué)的分析，從而研究組分結(jié)構(gòu)優(yōu)化前后組分內(nèi)代表成分的藥代動(dòng)力學(xué)特征，重點(diǎn)比較了Cmax、 t1/2以及AUC0～∞，結(jié)果表明與結(jié)構(gòu)優(yōu)化前相比，芎芍7∶3組分結(jié)構(gòu)中組分的生物利用度得到了提高，其半衰期也顯著延長(zhǎng)，證明芎芍組分結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，提高了組分的

13、生物利用度，促進(jìn)了吸收，藥效也相應(yīng)提高。這也為組分優(yōu)化前后藥效學(xué)的差異性提出了很好的解釋。組分結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，芍藥苷從A側(cè)到B側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯增加，其吸收系數(shù)PA-B也顯著提高至原來(lái)的1.5倍，分泌滲透系數(shù)PB-A也有所提高，但是并沒(méi)有顯著性差異，芎芍組分進(jìn)行組分結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，川芎總酚酸組分的存在能夠促進(jìn)芍藥苷的腸道吸收。組分結(jié)構(gòu)優(yōu)化后阿魏酸從A側(cè)到B側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯增加，其吸收系數(shù)PA-B也顯著提高，表觀滲透率（外排率）由0.86降低至0.68

14、，芎芍組分進(jìn)行組分結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，赤芍總苷組分能夠促進(jìn)阿魏酸在腸道吸收。結(jié)果表明芎芍組分結(jié)構(gòu)優(yōu)化后對(duì)赤芍總苷和川芎總酚酸的轉(zhuǎn)運(yùn)均有一定的促進(jìn)作用。腦部具有獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)，這些組分的協(xié)同作用是否與成分入腦性質(zhì)改變相關(guān)呢？本部分還以超高效液相色譜對(duì)芎芍組分結(jié)構(gòu)優(yōu)化前后組分腦組織分布情況進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)腦部組分含量及微，因此擬采用微透析技術(shù)對(duì)芎芍組分大鼠腦部含量進(jìn)行深入研究。
　　5.總結(jié)
　　本研究基于中醫(yī)藥“藥對(duì)”理論及物質(zhì)基礎(chǔ)“組