人血白蛋白制劑中蛋白組分的研究.pdf

1、人血白蛋白(Human serum albumin，HSA)是由健康人的血漿經(jīng)低溫乙醇分離提取并經(jīng)病毒滅活后制成的生物制品，臨床上用于出血性、外傷性體克、燒傷、肝硬化伴腹水和水腫、惡性腫瘤、腎病水腫等。
　　目前國(guó)內(nèi)企業(yè)采用低溫乙醇法壓濾工藝分離血漿蛋白，該工藝具有蛋白收率高，生產(chǎn)成本低，經(jīng)濟(jì)效益好，因而在工業(yè)化生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。然而低溫乙醇法特異性不高，在生產(chǎn)的過(guò)程中不能完全除去雜蛋白成分，各企業(yè)的工藝參數(shù)也不盡相同，因此在終產(chǎn)

2、品中會(huì)存在一定量的雜蛋白。據(jù)文獻(xiàn)表明，制劑中存在的這些雜蛋白是引起的臨床不良反應(yīng)的主要原因之一[1]，不良反應(yīng)類型主要為全身過(guò)敏反應(yīng)和多器官損壞，包括過(guò)敏性休克、熱原樣反應(yīng)、腎臟損害等。因此探究血液制品中的未知蛋白可為臨床不良反應(yīng)提供參考，本課題旨在建立雜蛋白分離分析的方法并測(cè)定人血白蛋白制劑中的雜蛋白的組成，為各企業(yè)的生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供了數(shù)據(jù)支持，同時(shí)為產(chǎn)品的一致性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。
　　為了初步了解各企業(yè)的雜蛋白含量和種類的差異，對(duì)

3、五家企業(yè)近兩年的批簽發(fā)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共獲得323批白蛋白制劑的純度數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，五家企業(yè)生產(chǎn)的白蛋白制劑純度范圍在96.2％～98.3%之間，企業(yè)間差異較大。其中A企業(yè)生產(chǎn)的制劑純度較為均一，提示生產(chǎn)工藝較為穩(wěn)定；B企業(yè)生產(chǎn)的制劑純度較其他四所企業(yè)低，顯示產(chǎn)品中存在一定量的未知蛋白。為了進(jìn)一步分析各企業(yè)制劑的蛋白組成異同，對(duì)白蛋白制劑進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，初步探究其組成成分的異同，結(jié)果顯示各企業(yè)間生產(chǎn)的白

4、蛋白制劑差異較小，各企業(yè)制劑的雜蛋白有8~9條帶。鑒于醋酸纖維素薄膜電泳與SDS-PAGE方法的局限性，不能特異性地鑒定出雜蛋白成分，本研究嘗試建立未知蛋白譜鑒定方法，進(jìn)而確定各企業(yè)生產(chǎn)的人血白蛋白制劑的未知蛋白組成。
　　在建立質(zhì)譜分析方法時(shí)，首先對(duì)供試品濃度進(jìn)行選擇，再對(duì)質(zhì)譜鑒定參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，白蛋白濃度超過(guò)5mg/ml時(shí)，超過(guò)儀器鑒定閾值，導(dǎo)致白蛋白主成分未能被成功鑒定，提示蛋白濃度不能過(guò)高。蛋白濃度在1mg/ml-

5、2mg/ml時(shí)，主成分白蛋白肽圖較為完整，但未知蛋白檢出效率低；對(duì)白蛋白肽圖中的肽段進(jìn)行b/y離子連續(xù)性分析發(fā)現(xiàn)，蛋白鑒定得分大于150分，結(jié)果具有較高的可信度。以上結(jié)果提示主成分蛋白濃度過(guò)高，掩蓋未知蛋白的的信號(hào)，未知蛋白的鑒定需要對(duì)未知蛋白進(jìn)一步分離。
　　結(jié)合前期結(jié)果，對(duì)各企業(yè)的白蛋白中未知成分進(jìn)行分離純化、酶切方法的優(yōu)化，確立其分離純化方法，并分析各企業(yè)未知蛋白的種類、數(shù)量、分子量、等電點(diǎn)分布及其工藝相關(guān)性。采用陰離子交換

6、柱與凝膠過(guò)濾層析柱分別對(duì)白蛋白進(jìn)行分離，結(jié)果顯示,使用陰離子交換層析只能得到主成分單一峰，而使用凝膠過(guò)濾層析得三組峰，因此采用凝膠過(guò)濾層析對(duì)白蛋白中位置組分進(jìn)行分離。采用胃蛋白酶和胰蛋白酶分別對(duì)各分離組分進(jìn)行酶切,結(jié)果顯示,胃蛋白酶酶切結(jié)果重復(fù)性較差且蛋白得分較低，而使用胰蛋白酶重現(xiàn)性良好，蛋白鑒定得分較高。對(duì)胰蛋白酶酶切效果進(jìn)行進(jìn)一步確證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),三次平行實(shí)驗(yàn),共有11個(gè)蛋白被檢出,其中共有8個(gè)蛋白每次均檢出,說(shuō)明方法穩(wěn)定性較好。最

7、終采用胰蛋白酶對(duì)人血白蛋白中的未知蛋白成分進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示五家生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品,除一家企業(yè)雜蛋白較少外，另外四家企業(yè)所有批次樣品均含有載脂蛋白A-Ⅱ（Apolipoprotein A-II）、人結(jié)合珠蛋白（Haptoglobin）、人血色素結(jié)合蛋白（Hempoexin）、α-1B-糖蛋白（Alpha-1B-glycoprotein）、α-2-HS-糖蛋白（Alpha-2HS-glycoprotein），且略有差異。對(duì)未知蛋白等電點(diǎn)進(jìn)行分析

8、發(fā)現(xiàn)，未知蛋白等電點(diǎn)與白蛋白較接近，可能在乙醇共沉淀時(shí)與白蛋白共同析出，初步可以說(shuō)明未知蛋白為工藝相關(guān)蛋白；對(duì)未知蛋白分子量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，未知蛋白以多聚體的形式存在于白蛋白中。
　　以上結(jié)果表明，在臨床應(yīng)用中，應(yīng)更加關(guān)注上述未知蛋白的過(guò)敏效應(yīng)，在工業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)優(yōu)化生產(chǎn)工藝，盡可能去除無(wú)關(guān)蛋白，提高產(chǎn)品質(zhì)量。本課題建立的白蛋白制劑雜蛋白質(zhì)譜分析方法為探究臨床不良反應(yīng)提供了數(shù)據(jù)支持，為白蛋白制劑的一致性評(píng)價(jià)提供了新的方法，為血液制品的