NF-κB-HSP27路徑在熱應(yīng)激致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　本研究在于探討熱打擊誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，闡明介導(dǎo)熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路、上游信號(hào)分子以及中間環(huán)節(jié)各信號(hào)分子之間的相互作用，從分子水平上了解熱打擊誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制，為揭示中暑內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的病理過(guò)程奠定基礎(chǔ)，也為臨床中暑預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
　　方法和結(jié)果:
　　1.分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞并建立熱應(yīng)激模型，熱應(yīng)激恢復(fù)期NF-κB是否發(fā)生活化及其具體其活化機(jī)制
　　按照參考文獻(xiàn)分離人臍靜

2、脈內(nèi)皮細(xì)胞并用用VE-cadherin和VEGFR-2鑒定細(xì)胞表型。43℃，90min熱打擊后不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)(0、2、6、12h)及37℃對(duì)照組細(xì)胞，使用熒光顯微鏡觀察NF-κBp65的定位。并提取胞漿胞核蛋白，使用Westem blotting定量分析其在核內(nèi)水平，使用試劑盒檢測(cè)NF-κBp65的DNA連接活性。Western blotting檢測(cè)IKK-α/β、IκB-α、p65表達(dá)及磷酸化水平變化。熱應(yīng)激早期并不能使NF-κB發(fā)生

3、活化，隨著恢復(fù)期延長(zhǎng)NF-κB可發(fā)生活化，熱打擊早期及恢復(fù)期并不能使得IKK-α/β發(fā)生磷酸化，但I(xiàn)κB噸在熱應(yīng)激早期及恢復(fù)期均發(fā)生磷酸化，但未發(fā)生降解。p65在熱應(yīng)激早期未發(fā)生磷酸化，但在恢復(fù)期可被激活從而發(fā)生磷酸化修飾。構(gòu)建IκB-α磷酸化位點(diǎn)的抑制性突變從而抑制其磷酸化，其并未改變熱應(yīng)激恢復(fù)期12 h p65磷酸化水平，也未改變p65的核轉(zhuǎn)位。熱打擊恢復(fù)期IκB-α同p65一起發(fā)生核轉(zhuǎn)位，同時(shí)我們使用小分子干擾RNA敲除p65，發(fā)

4、現(xiàn)在熱應(yīng)激恢復(fù)期(2、6、12 h) IκB-α表達(dá)水平也發(fā)生降低，使用免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)正常及熱應(yīng)激情況下IκB-α同p65均未發(fā)生解離，在熱應(yīng)激時(shí)一齊轉(zhuǎn)入到核內(nèi)共同調(diào)控基因表達(dá)，同時(shí)使用LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞作為陽(yáng)性參照，使用LPS刺激后IκB-α可與p65發(fā)生解離。
　　2.NF-κBp65及HSP27蛋白在所建立的熱應(yīng)激內(nèi)皮細(xì)胞模型中產(chǎn)生相互作用共同介導(dǎo)抗凋亡功能
　　使用NF-κB活化抑制劑BAY11-7082，或使用p

5、65-siRNA降低細(xì)胞p65蛋白的表達(dá)，熱打擊抑制劑預(yù)處理的細(xì)胞及p65-siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。結(jié)果顯示使用抑制劑BAY11-7082或p65-siRNA明顯增加了熱打擊誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)也增加了熱打擊誘導(dǎo)Caspase-3的活化。分別使用小分子干擾RNA降低HSP27表達(dá)及腺病毒過(guò)表達(dá)HSP27，給予43℃，90 min熱應(yīng)激后恢復(fù)期12h流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，HSP27siRNA處理的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加，Caspase-

6、3的活化程度增加，Ad-HSP27預(yù)處理的細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著降低，Caspase-3的活化程度也發(fā)生降低。這一結(jié)果說(shuō)明了NF-κB和HSP27在熱應(yīng)激致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起著抗凋亡的作用。
　　為進(jìn)一步研究?jī)烧哧P(guān)系，使用熒光顯微鏡觀察正常及熱應(yīng)激情況下p65及HSP27在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，結(jié)果顯示正常情況下p65及HSP27都處于細(xì)胞漿分布，當(dāng)給予43℃，90min熱應(yīng)激恢復(fù)期12 h p65及HSP27主要分布在細(xì)胞核中。給予NF-κ

7、B活化抑制劑BAY11-7082預(yù)處理細(xì)胞，熱應(yīng)激恢復(fù)期12h，BAY11-7082預(yù)處理組細(xì)胞p65核轉(zhuǎn)位明顯減少，同時(shí)HSP27在核內(nèi)的累積也發(fā)生減低。故推測(cè)p65與HSP27之間可能存在相互作用，使用免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)在正常情況下，p65與HSP27存在連接，給予熱應(yīng)激后兩者產(chǎn)生相互作用共同轉(zhuǎn)移到核內(nèi)。使用小分子干擾RNA降低HSP27的表達(dá)明顯降低NF-κB p65的DNA轉(zhuǎn)錄活性，使用腺病毒過(guò)表達(dá)HSP27并未對(duì)NF-κB p6

8、5的DNA連接活性產(chǎn)生明顯影響，其可能與熱打擊本身可使HSP27表達(dá)升高，故熱應(yīng)激后HSP27與p65作用位點(diǎn)已經(jīng)飽和，故給予過(guò)表達(dá)并不能得出顯著結(jié)果。
　　進(jìn)一步分析了NF-κB活化是否對(duì)HSF-1表達(dá)及活化產(chǎn)生影響從而對(duì)HSP27的表達(dá)起著間接作用。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞給予43℃熱應(yīng)激，Westernblotting檢測(cè)其熱應(yīng)激過(guò)程中及其恢復(fù)期(15，30，60 min，R2，R6，R12 h) HSF1表達(dá)及磷酸化情況，同時(shí)提取

9、胞漿胞核蛋白Western blotting檢測(cè)熱應(yīng)激恢復(fù)期(0、2、6、12 h) HSF1的核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果顯示熱應(yīng)激早期15 min HSF1即已發(fā)生磷酸化，持續(xù)至恢復(fù)期6h，直至恢復(fù)期12h恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，而HSF1表達(dá)水平并未升高反而發(fā)生降低，其分子量較正常升高，正常情況下HSF1在胞漿內(nèi)呈單體狀態(tài)，給予熱應(yīng)激后單體匯合形成三聚體，轉(zhuǎn)移到核內(nèi)調(diào)控?zé)嵝菘说鞍椎霓D(zhuǎn)錄，故熱應(yīng)激后HSF1分子量較正常大，故在Western blott

10、ing圖中條帶位置顯示較高。給予熱應(yīng)激后，HSF1可發(fā)生核轉(zhuǎn)位，恢復(fù)期0-2 h較為顯著，恢復(fù)期6-12hHSF1在核內(nèi)的累積發(fā)生明顯下調(diào)。給予HSF1 siRNA降低HSF1表達(dá)及Ad-HSF1對(duì)HSF1過(guò)表達(dá)，Western blotting驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效果及HSP27表達(dá)情況，在正常及熱應(yīng)激情況下，HSF1均可對(duì)HSP27表達(dá)起調(diào)控作用。我們使用p65siRNA檢測(cè)其在熱應(yīng)激情況下對(duì)HSF1核轉(zhuǎn)位及磷酸化的影響，結(jié)果顯示p65siR

11、NA處理細(xì)胞在熱應(yīng)激恢復(fù)期6h并不影響HSF1的核轉(zhuǎn)位，同時(shí)p65siRNA處理的細(xì)胞在熱應(yīng)激恢復(fù)期(2、6、12h)對(duì)HSF1的磷酸化水平也未產(chǎn)生明顯作用。
　　使用CHIP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NF-κBp65在HSP27啟動(dòng)子區(qū)域是否存在結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)使用HSF1作為陽(yáng)性參照來(lái)驗(yàn)證整個(gè)CHIP系統(tǒng)是否有效。結(jié)果顯示HSF1在正常及熱應(yīng)激情況下在HSP27啟動(dòng)子區(qū)域都存在結(jié)合位點(diǎn)并對(duì)HSP27表達(dá)起調(diào)控作用，而NF-κBp65在HSP

12、27啟動(dòng)子區(qū)域并未發(fā)現(xiàn)結(jié)合，但我們使用RNApolII文獻(xiàn)中報(bào)道其含有NF-κBp65的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其與HSP27啟動(dòng)子結(jié)合增多，我們將NF-κBp65敲除后，發(fā)現(xiàn)RNA polII對(duì)HSP27啟動(dòng)子結(jié)合明顯降低，從而從側(cè)面可得出NF-κBp65對(duì)HSP27在轉(zhuǎn)錄水平上可能起著調(diào)控作用。
　　3.NF-κB p65通過(guò)抑制熱應(yīng)激致ROS在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)累積，從而抑制下游MAPKs家族活化，最終起著抗凋亡作用。
　　提取熱應(yīng)

13、激不同時(shí)間及熱應(yīng)激90min后不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)(0、2、4、6、12、24 h)和37℃對(duì)照組的HUVEC細(xì)胞總蛋白，Western blot方法分析MAPK家族活化情況;結(jié)果表明熱應(yīng)激早期ERK、p38在熱應(yīng)激15 min即可發(fā)生磷酸化，JNK在熱應(yīng)激60 min發(fā)生磷酸化，在熱應(yīng)激恢復(fù)期MAPKs家族磷酸化被快速誘導(dǎo)，熱應(yīng)激恢復(fù)期4h仍維持在高水平，6h開(kāi)始降低至基線水平，我們給予NF-κB活化抑制劑BAY11-7082及SN50預(yù)處

14、理細(xì)胞，熱應(yīng)激恢復(fù)期6h時(shí)間點(diǎn)提取蛋白MAPKs家族活化，結(jié)果顯示給予抑制劑處理組MAPKs活化時(shí)間延長(zhǎng)且活化強(qiáng)度增加，同時(shí)我們使用p65siRNA處理細(xì)胞檢測(cè)熱應(yīng)激恢復(fù)期(2、6、12 h) MAPKs家族活化情況，結(jié)果表明p65siRNA處理組細(xì)胞MAPKs家族活化強(qiáng)度較NCsiRNA處理組增加。故NF-κB活化可介導(dǎo)MAPKs的強(qiáng)度增加及時(shí)間延長(zhǎng)。
　　同時(shí)使用ROS清除劑APO及NAC預(yù)處理細(xì)胞檢測(cè)熱應(yīng)激恢復(fù)期12h內(nèi)皮細(xì)

15、胞凋亡情況，結(jié)果表明經(jīng)APO及NAC預(yù)處理的細(xì)胞凋亡明顯降低，經(jīng)APO預(yù)處理的細(xì)胞其Caspase-3活性明顯降低。使用ERK活化抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125及p38活化抑制劑SB203580預(yù)處理細(xì)胞，Western blot方法驗(yàn)證抑制劑效果，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，SP600125及SB203580預(yù)處理細(xì)胞后其凋亡數(shù)目較DMSO對(duì)照組明顯降低，而PD98059預(yù)處理細(xì)胞組較DMSO對(duì)照組凋亡數(shù)目明顯增多

16、。以上結(jié)果表明熱應(yīng)激使ROS在胞內(nèi)過(guò)度累積從而導(dǎo)致凋亡發(fā)生，p38及JNK在熱打擊內(nèi)皮細(xì)胞模型中起著促凋亡作用，ERK起著抗凋亡的作用。
　　結(jié)論：
　　1.熱應(yīng)激可使NF-κB發(fā)生活化，其活化的機(jī)制為非經(jīng)典途徑，其不伴有IκB-α的解離與降解，而是與p65一起轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB的活化可能與其自身的熱敏性有關(guān)。
　　2.NF-κBp65及HSP27蛋白在所建立的熱應(yīng)激內(nèi)皮細(xì)胞模型中起著抗凋亡的作用。在正

17、常情況下NF-κB p65與HSP27在胞漿內(nèi)分布并存在連接，在給予熱刺激后兩者一起轉(zhuǎn)入核內(nèi)，熱應(yīng)激致HSP27表達(dá)增加及核轉(zhuǎn)位其可使NF-κB p65維持其轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)NF-κB p65對(duì)HSP27可能存在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。
　　3.NF-κB p65作為上游抑制熱應(yīng)激致ROS在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)累積，從而抑制下游MAPKs家族活化，最終起著抗凋亡的作用，但這種作用并不完全;熱應(yīng)激使ROS在胞內(nèi)過(guò)度累積從而導(dǎo)致凋亡發(fā)生，p38及JNK在熱