NF-κB在孕鼠深靜脈血栓血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及其抑制劑的干預(yù)作用.pdf

1、[研究背景與目的]
　　 深靜脈血栓(deepveinthrombosis，DVT)是一種常見的血管血栓性疾病，DVT的急性期容易導(dǎo)致肺栓塞，存在致死性，越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。英國(guó)學(xué)者統(tǒng)計(jì)妊娠期DVT發(fā)病率為0.05％～0.10％，近年來妊娠期和產(chǎn)褥期深靜脈血栓的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。妊娠期由于生理性獲得性易栓因素的存在和血液高凝狀態(tài)是導(dǎo)致其發(fā)病率增高的重要原因。目前公認(rèn)Virchow提出血流滯緩、血液高凝、靜脈壁的損傷是靜脈

2、血栓形成的三大因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)炎癥與深靜脈血栓的形成和發(fā)展有著密切關(guān)系，炎癥反應(yīng)介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血流淤滯，從而促進(jìn)靜脈血栓形成;血栓的形成加劇炎癥反應(yīng)，兩者相互影響。已有大量的病理學(xué)和血清炎癥與靜脈血栓的相互關(guān)系提供有力的依據(jù)。因此研究靜脈血栓發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的調(diào)控炎癥因子的蛋白對(duì)于延緩、減輕靜脈血栓形成及預(yù)后的判斷具有重要的意義。
　　 核轉(zhuǎn)錄因子(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)是由Sen和Ba

3、ltimore發(fā)現(xiàn)以能與B細(xì)胞免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子κB序列（GGGACTTTCC）特異結(jié)合而命名。NF-κB是近年來發(fā)現(xiàn)重要的轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞中普遍存在的具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的序列特異性DNA結(jié)合蛋白。NF-κB通常與抑制蛋白(IκB)結(jié)合成三聚體，以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激原如紫外輻射、細(xì)胞因子、活性氧作用時(shí)，NF-κB與IκB解離并進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合靶基因啟動(dòng)子以激動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。目前已在淋巴細(xì)胞激活、敗血癥

4、、急性炎癥反應(yīng)綜合征(AIRS)、肝臟缺血再灌注損傷、腫瘤血管新生方面等疾病中發(fā)現(xiàn)NF-κB蛋白的作用。
　　 越來越多研究表明在炎癥反應(yīng)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，NF-κB的激活可能是一個(gè)中心環(huán)節(jié)。NF-κB在炎癥細(xì)胞激活的信號(hào)調(diào)控中起著重要作用，通過活化中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，使細(xì)胞釋放一系列粘附分子、細(xì)胞因子、酶類等介質(zhì)，介導(dǎo)或直接參與白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用以及組織的損傷。NF-κB控制著炎癥及免疫相關(guān)基因的表達(dá)，這些基

5、因涉及到中毒性休克、急性期反應(yīng)、輻射損傷、哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥等多種疾病過程，因此可以通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性來治療這些疾病。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)作為NF-κB特異性的抑制劑，理論上可減少NF-κB的核移位進(jìn)而抑制NF-κB的活化。基于這種思路，探討NF-κB在靜脈血栓發(fā)生發(fā)展階段中表達(dá)的量化特點(diǎn)及變化規(guī)律的研究，是否可通過抑制其活性及相應(yīng)細(xì)胞因子的分泌，改善炎癥反應(yīng)，從而影響血栓的形成。探討NF-κB

6、激活的信號(hào)通路能否作為新型藥物靶點(diǎn)的研究方向，為防治深靜脈血栓提供初步的理論依據(jù)。
　　 因此，本實(shí)驗(yàn)采用下腔靜脈結(jié)扎法建立孕鼠深靜脈血栓模型，進(jìn)一步從量化水平探討深靜脈血栓形成后血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB蛋白的表達(dá)特點(diǎn)，初步分析NF-κB蛋白與深靜脈血栓發(fā)生發(fā)展的關(guān)系;分析NF-κB蛋白的表達(dá)水平與血栓形成情況的相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)使用NF-κB的抑制劑PDTC干預(yù)孕鼠，再探討其干預(yù)作用對(duì)NF-κB蛋白的表達(dá)及形成血栓的大小有何影響

7、。
　　 [材料與方法]
　　 1、54只SD大鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，常規(guī)飼養(yǎng)一周后，以2:1雌性與雄性SD大鼠合籠，各組大鼠孕10-15天行DVT造模，其中48只隨機(jī)分為血栓模型組、PDTC干預(yù)組，根據(jù)6h、12h、24h、72h時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為四個(gè)亞組，各點(diǎn)為6只，其余6只為假手術(shù)組。
　　 2、采用下腔靜脈結(jié)扎法建立孕鼠深靜脈血栓模型，血栓模型組和PDTC干預(yù)組在造模前1h分別給予腹腔注射0.9％生

8、理鹽水和PDTC(100mg/kg/d)，每24h注射1次，72h即注射3次。
　　 3、分別在建模后規(guī)定的各時(shí)間點(diǎn)分批處死動(dòng)物，稱取形成血栓的濕重和測(cè)量其長(zhǎng)度，比較兩組血栓形成情況。靜脈血栓組織放至10％中性福爾馬林液中固定以備HE染色和免疫組化檢測(cè)。
　　 4、HE染色后，在光鏡下觀察各組下腔靜脈血栓病理形態(tài)學(xué)改變和炎癥細(xì)胞的表達(dá)，采用免疫組化半定量圖像分析法檢測(cè)各組DVT血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB蛋白的表達(dá)水平，用I

9、mageproplus圖像分析技術(shù)測(cè)量NF-κB蛋白的陽(yáng)性單位（Meanopticaldensity，IOD），分析不同時(shí)間點(diǎn)組織中NF-κB蛋白表達(dá)強(qiáng)度的特點(diǎn)及與DVT之間的關(guān)系，分析各組血栓形成情況與NF-κB蛋白表達(dá)的相關(guān)關(guān)系。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所得的數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，各組數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±s)表示。采用析因設(shè)計(jì)的方差分析各組間血栓濕重與長(zhǎng)度比值及NF-κBIOD值，同一時(shí)間點(diǎn)兩組間的比

10、較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，分析各組及組間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間相關(guān)性分析采用雙變量相關(guān)分析，服從雙變量正態(tài)分布資料選擇Pearson相關(guān)系數(shù)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 一、孕鼠深靜脈血栓模型的建立及檢測(cè)
　　 1、利用結(jié)扎法結(jié)扎下腔靜脈和及其兩側(cè)髂腰支，可成功的構(gòu)建孕鼠深靜脈血栓模型。
　　 2、建模后各時(shí)間點(diǎn)均可見明顯的下腔靜脈血栓的形成，術(shù)后可見形成的紅色血栓或混合

11、血栓，血栓質(zhì)地松軟，靜脈壁柔軟，尚富有彈性，擠壓血栓塊可從血管壁脫出，靜脈壁與周圍組織無明顯粘連。術(shù)后72h形成層狀血栓，血栓質(zhì)地較硬，靜脈壁較韌，靜脈壁與周圍組織粘連緊密。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，形成血栓濕重與血栓長(zhǎng)度比值增加。
　　 3、HE染色光鏡下觀察術(shù)后6h、12h可見形成的紅色血栓為主，24h形成的混合血栓為主，72h可見層狀血栓的形成，靜脈血栓血管壁周圍伴隨著炎癥細(xì)胞增多，明顯炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞以24h、72h明顯增多。

12、r>　　 二、深靜脈血栓血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)的定量分析
　　 1、正常孕鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB表達(dá)弱，NF-κB蛋白的IOD值以DVT形成后6h開始升高，24h達(dá)高峰，72h后下降。
　　 2、NF-κBp65蛋白的IOD值(0.72+0.23)在血栓血管內(nèi)皮細(xì)胞中與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(0.12+0.04)中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-6.379，P=0.000）。
　　 三、PDTC干預(yù)DVT

13、后形成的血栓濕重與血栓長(zhǎng)度的比值情況
　　 血栓模型組形成的血栓濕重與長(zhǎng)度比值顯著高于PDTC干預(yù)組（F=5.755，P=0.021），PDTC藥物干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)形成血栓濕重與血栓長(zhǎng)度比值有顯著差異(F=4.394，P=0.009)。PDTC干預(yù)72h后血栓濕重與血栓長(zhǎng)度比值顯著低于血栓模型組(P=0.047)，而在6h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)中血栓濕重與長(zhǎng)度比值相比無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 四、PDTC干預(yù)

14、DVT后血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κBp65的表達(dá)情況
　　 1、PDTC干預(yù)組靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB平均光密度值均明顯低于血栓模型組(F=17.276，P=0.000)，PDTC干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB平均光密度值有顯著性差異(F=15.685，P=0.000)。
　　 2、應(yīng)用PDTC干預(yù)后NF-κB蛋白的表達(dá)水平較血栓模型組下降，但以PDTC干預(yù)12h(P=0.046)、24h(P=0.044)、72h(P=0.

15、016)后NF-κBp65平均光密度值明顯低于血栓模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 五、深靜脈血栓血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB蛋白與血栓大小的相關(guān)性分析
　　 正常靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、血栓模型組和PDTC干預(yù)組相比較，三者中NF-κB蛋白表達(dá)的強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.704，P=0.000);深靜脈血栓血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB蛋白的表達(dá)水平與血栓濕重/長(zhǎng)度比值大小呈正相關(guān)(r=0.392，P=0.006)。
　　

16、[結(jié)論]
　　 一、應(yīng)用下腔靜脈結(jié)扎法成功的構(gòu)建了孕鼠深靜脈血栓模型，并于6h、12h、24h、72h觀察到不同時(shí)間段的血栓形成和靜脈血管壁周圍的炎癥反應(yīng)，表明炎癥參與靜脈血栓的發(fā)生發(fā)展。
　　 二、NF-κB蛋白在正常靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)，在血栓血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示深靜脈血栓形成后NF-κB蛋白明顯激活。NF-κB的抑制劑PDTC干預(yù)DVT后NF-κB蛋白的表達(dá)水平明顯下降，炎癥反應(yīng)減輕。
　　 三