改進(jìn)型復(fù)制缺陷性腺病素(HDAd)轉(zhuǎn)基因載體特異性及穩(wěn)定性研究.pdf

1、背景:自我復(fù)制缺陷性腺病毒(HDAd)和慢病毒(LV)是轉(zhuǎn)基因治療中極具吸引力的病毒載體。在質(zhì)粒載體中的測試已經(jīng)確認(rèn)人工合成的啟動子△USEx3具有肌細(xì)胞特異性表達(dá)的特點(diǎn)。本實(shí)驗以兩種不同的病毒為模板構(gòu)建含有啟動子△USEx3的基因載體，檢測其組織特異性及轉(zhuǎn)基因表達(dá)的穩(wěn)定性。細(xì)胞核支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)(Scaffold/matrix-attached regions，S/MAR)基因，在基因表達(dá)中具有非常重要的作用，能增加質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水

2、平，可以預(yù)防轉(zhuǎn)基因沉默，通過構(gòu)建含有S/MAR的HDAd，檢測S/MAR在HDAd中是否仍具有防止轉(zhuǎn)基因衰退的作用。
　　 方法:構(gòu)建兩種表達(dá)β-半乳糖苷酶的HDAd載體，分別受△USEx3或者CMV(或CAG)啟動子調(diào)控;構(gòu)建兩種表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒，分別受△USEx3或者CMV調(diào)控，在非肌源性細(xì)胞(HeLa, Jurkat,293A，A549)、成肌細(xì)胞和肌管細(xì)胞中比較轉(zhuǎn)基因的表達(dá)情況。構(gòu)建兩種表達(dá)GFP的HD

3、Ad載體，一個含有S/MAR基因，一個沒有，在HeLa細(xì)胞中培養(yǎng)，比較GFP表達(dá)。
　　 結(jié)果:在非肌源性細(xì)胞中，△USEx3調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)是CAG或CMV表達(dá)值的1％或更少，△USEx3在A549細(xì)胞中表達(dá)范圍是CAG或CMV表達(dá)值的5-12％?！鱑SEx3在成肌細(xì)胞表達(dá)為0.5％和29％，與CAG或CMV相比，具有顯著差異性(p＜0.05)。但在肌管細(xì)胞中，△USEx3與CMV基因表達(dá)具有同樣強(qiáng)度，說明△USEx3在肌細(xì)胞中

4、是個很強(qiáng)的啟動子。在體內(nèi)實(shí)驗中，△USEx3轉(zhuǎn)基因在肺、肝和脾中的表達(dá)值是CAG表達(dá)值的2％或者更少，但在肌肉中是10％。脛骨前肌(tibialis anterior)注射△USEx3-HDAd，28％的肌纖維β-半乳糖苷酶表達(dá)陽性。在慢病毒穩(wěn)定性實(shí)驗中，△USEx3調(diào)控的GFP表達(dá)也比CMV持久。另一個實(shí)驗中，持續(xù)的檢測發(fā)現(xiàn)，具有S/MAR轉(zhuǎn)基因的HeLa細(xì)胞GFP表達(dá)下降比例要比沒有S/MAR轉(zhuǎn)基因的HeLa細(xì)胞小且慢。