天然復(fù)雜型N-糖苷分離與糖肽的酶法合成.pdf

1、糖蛋白具有重要的生理和生化作用，但以目前的技術(shù)獲得均一糖蛋白很困難，因此對其結(jié)構(gòu)和功能的研究非常緩慢。體外糖鏈人源化的改造主要是利用酶的合成活性進行糖肽的定向合成，將完整的N-糖苷直接連到肽鏈的糖基化位點上。因糖苷不易以化學方法或者酶法大量合成，因此從自然界中分離天然的N-糖苷便成為獲得N-糖苷的最有效的方式。本實驗從雞蛋蛋黃中分離到復(fù)雜型N-糖苷，并嘗試了兩種酶法合成糖肽。 雞蛋蛋黃中富含復(fù)雜型的N-唾液酸寡糖，可為糖肽的體

2、外合成提供豐富的N-糖苷來源，并且雞蛋中含有的N-糖苷與人體內(nèi)N-糖苷極其相似，因此獲得雞蛋蛋黃中的N-糖苷具有重要的意義。本實驗改進了Akira Seko等人提出的分離方法，大大縮短了分離時間，提高了分離效率。按照Akira Seko的方法，從100個雞蛋蛋黃中分離得到糖肽SGP大約需要五個半月的時間，用改進法1純化，大約需要四個半月的時間，而使用改進法2大約只需兩個月的時間。從100個雞蛋中，用Akira Seko的方法大約得到24

3、0 mg SGP和12 mg寡糖苷FSG，用改進法1大約得到300 mg SGP，15 mg FSG，用改進法2大約得到340 mg SGP。利用改進法2純化SGP，純化效率提高了41％，純化時間僅為原來的45％，并且節(jié)約了試驗試劑等費用，為大量生產(chǎn)糖苷或者糖肽奠定了試驗基礎(chǔ)。SG是只帶有Asn的復(fù)雜型寡糖，相比帶有6個氨基酸的SGP來說，更容易用化學法保護、修飾，保護修飾后的SG可作為底物，以固相合成法合成具有所需肽鏈序列的糖肽。1

4、mg SGP經(jīng)pronase酶切、Graphic Carbon純化后可得到0．73 mg SG，純化效率可達到80％。SG的市場價格大約為RMB 20000/ mg。 蛋白酶中的半胱氨酸蛋白酶在一定的條件下具有逆反應(yīng)活性，可以形成酰胺鍵合成肽鏈?；诖呋行暮驼磻?yīng)催化機理的相似性，本實驗探索了來源于釀酒酵母的糖酰胺酶（Pnglp）是否具有逆反應(yīng)活性，即合成糖酰胺鍵形成糖肽。合成的促紅細胞生成素糖基化位點八肽（底物）在2h后開

5、始逐漸丟掉Asp的γ位羧基的保護甲基，在4h后，一半的八肽都失去了甲基。如果Asp的γ位羧基失去了保護甲基，由甲酯變成了羧基，則失去了作為Pnglp合成糖肽的底物的活性。因此，合成糖肽的反應(yīng)時間應(yīng)該少于4h。丙酮濃度大于8％時，Pnglp的酶切活性顯著降低，超過10％則失去了酶切活性，因此選用8％的丙酮作為提高反應(yīng)速率的有機溶劑。在8％丙酮存在的條件下，檢測不同時間Pnglp的酶切活性，發(fā)現(xiàn)2h之內(nèi)均有活性。綜合以上優(yōu)化條件，最終選取8

6、％丙酮和2h，作為檢測酶法合成糖肽的條件。經(jīng)LC-MS檢測，并未檢測到可利用Pnglp逆反應(yīng)合成的糖肽。 實驗證明在大腸桿菌中重組表達來源于擬南芥的AtPnglp，該酶表現(xiàn)為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，而作為糖酰胺酶活性很低。Andreas Diepold等人證明AtPnglp在釀酒酵母中重組表達為糖酰胺酶活性，而不具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。結(jié)合上述兩種結(jié)果可以得出結(jié)論：AtPnglp在不同的微生物中重組表達，表現(xiàn)出不同的活性；在原核生物大