基于糖苷內(nèi)切酶的N-糖鏈分析方法研究.pdf

1、糖鏈具有結(jié)構(gòu)多樣化的特點，對于糖鏈的研究具有現(xiàn)實意義。糖鏈攜帶復(fù)雜的生物信息，與遺傳、病理及人類生命活動有直接聯(lián)系。糖基化過程與生理生化過程密切相關(guān)，也與癌癥等多發(fā)疾病的發(fā)生及病變有關(guān)，本文選用兩種糖苷內(nèi)切酶Endo M和Endo M-N-175Q建立一種分析N-糖鏈的方法。Endo M-N-175Q作為Endo M的突變體，在保留轉(zhuǎn)糖基活性的同時幾乎喪失了水解活性，因此在延長酶反應(yīng)時間的同時具有更高的轉(zhuǎn)糖基效率。同時介紹了脫鹽技術(shù)的發(fā)

2、展情況，重點說明了采用石墨碳柱進行純化和富集的簡便性、高效性，本文通過對石墨碳柱富集寡糖洗脫方式的選擇、酶切糖蛋白的酶的選擇來建立一種分析糖蛋白中N-糖鏈的方法，成功將此方法應(yīng)用于復(fù)雜糖蛋白卵清蛋白的分析實驗當(dāng)中，成功檢測到八種寡糖。根據(jù)報導(dǎo)，惡唑啉無論是在化學(xué)糖基化法和化學(xué)酶糖基化法上面是已知的非常好的糖基供體。在以惡唑啉為底物時，使用Endo M-N-175Q進行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)轉(zhuǎn)移率可達到90％以上。以此為前提，為了進一步提高酶反應(yīng)的轉(zhuǎn)

3、移率，通過合成糖惡唑啉探索提高酶反應(yīng)轉(zhuǎn)移率的方法。
　　本文通過四組實驗對N-糖鏈進行分析研究。首先，唾液酸糖肽經(jīng)鏈霉蛋白酶E酶解，酶解產(chǎn)物通過石墨碳柱富集后進行Endo M-N-175Q酶反應(yīng)，通過LC-ESI-MS檢測產(chǎn)物生成與否最終從三種不同的洗脫方式選擇中性洗脫方式作為富集寡糖的方法，將此方法應(yīng)用于后續(xù)實驗。其次，兩組標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白牛胰核糖核酸酶B分別經(jīng)鏈霉蛋白酶E和N-糖苷酶F酶解，酶解得到的寡糖通過石墨碳柱富集后進行End

4、o M-N-175Q酶反應(yīng)，經(jīng)LC-ESI-MS檢測。前者得到一種寡糖M5N2，后者得到三種寡糖M5N2、 M6N2、 M8N2且含量高于前者，選用N-糖苷酶F酶解糖蛋白。接著，將前文方法應(yīng)用于復(fù)雜糖蛋白卵清蛋白中N-糖鏈的分析上，用N-糖苷酶F酶解卵清蛋白，酶解產(chǎn)物通過石墨碳柱富集，進行Endo M-N-175Q酶反應(yīng)后經(jīng)LC-ESI-MS檢測得到M5N2等八種寡糖。最后，使用氮乙酰葡糖胺成功合成糖惡唑啉，將這一方法應(yīng)用到唾液酸糖肽上