特異性敲除B淋巴細(xì)胞TSC1對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的影響.pdf

1、目的：
　　本課題主要研究了以下內(nèi)容:
　　1、利用同窩陰性小鼠作為對(duì)照小鼠，驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)中所采用的DMM手術(shù)誘導(dǎo)小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的效果，以及術(shù)后小鼠血清，脾臟和滑膜組織中炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα的變化情況;
　　2、通過(guò)B淋巴細(xì)胞特異敲除TSC1，再利用DMM手術(shù)建立骨關(guān)節(jié)炎模型，闡明在B細(xì)胞特異性上調(diào)mTORC1對(duì)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程的影響。
　　方法：
　　1、應(yīng)用由美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室

2、購(gòu)買的CD19-Cre小鼠及TSC1-loxP小鼠，利用Cre-loxP系統(tǒng)，我們構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細(xì)胞敲除TSC1的小鼠模型。應(yīng)用PCR及瓊脂糖凝膠電泳對(duì)小鼠進(jìn)行基因型鑒定。應(yīng)用western blot技術(shù)確定小鼠的敲除效果。
　　2、通過(guò)組織學(xué)切片染色，即Safranin-O/Fast Green染色和toluidine blue染色，并利用染色結(jié)果通過(guò)modified Mankin評(píng)分系統(tǒng)及對(duì)關(guān)節(jié)軟骨厚度進(jìn)行測(cè)量，分析在

3、B細(xì)胞TSC1缺失后對(duì)小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度的影響。
　　3、通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry，IHC)觀察在B細(xì)胞TSC1缺失后小鼠膝關(guān)節(jié)切片MMP-13的表達(dá)情況，并利用qPCR技術(shù)分析小鼠關(guān)節(jié)軟骨中二型膠原和十型膠原的表達(dá)量來(lái)判斷小鼠關(guān)節(jié)軟骨的退化嚴(yán)重程度。
　　4、通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)分析在B細(xì)胞敲除TSC1對(duì)小鼠血清中炎性細(xì)胞因子IL-1β，IL-6，TNFα在骨關(guān)節(jié)炎過(guò)程中表達(dá)

4、情況的影響。
　　5、通過(guò)qPCR技術(shù)分析在B細(xì)胞敲除TSC1對(duì)小鼠膝關(guān)節(jié)滑膜及脾臟B淋巴細(xì)胞等組織中炎性細(xì)胞因子IL-1β，IL-6，TNFα的mRNA表達(dá)情況的影響。
　　結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的B淋巴細(xì)胞特異性敲除TSC1小鼠模型。
　　利用Cre-loxP系統(tǒng)成功構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細(xì)胞特異性TSC1敲除的小鼠(KO mice)。經(jīng)PCR檢測(cè)基因型及western blot檢測(cè)B淋巴細(xì)胞和骨髓

5、中TSC1及其下游pS6的蛋白表達(dá)水平，證實(shí)了敲除小鼠的B淋巴細(xì)胞確實(shí)缺乏TSC1蛋白的表達(dá)，且其mTORC1的活性是上升的。
　　2、DMM手術(shù)構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎模型效果良好。
　　將同窩陰性對(duì)照小鼠(CON mice)分為DMM手術(shù)組(DMM group)和假手術(shù)組(SHAM group)。分別于術(shù)后4周和8周取兩組小鼠的膝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織切片，利用Safranin-O/Fast Green染色和toluidine blue染色觀

6、察關(guān)節(jié)軟骨的變化情況，同時(shí)根據(jù)modified Mankin評(píng)分系統(tǒng)并對(duì)關(guān)節(jié)軟骨厚度進(jìn)行測(cè)量。Safranin-O/Fast Green染色結(jié)果顯示DMM手術(shù)組相對(duì)于假手術(shù)組modified Mankin評(píng)分明顯升高，toluidine blue染色結(jié)果表明關(guān)節(jié)軟骨厚度明顯變薄。除此之外，分別于術(shù)后4周和8周取兩組小鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)滑膜組織中炎性細(xì)胞因子IL-1β，IL-6，TNFα的mRNA表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示

7、DMM手術(shù)組炎性細(xì)胞因子IL-1β，IL-6，TNFα的mRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組。上述結(jié)果證實(shí)DMM手術(shù)建立骨關(guān)節(jié)炎模型效果明顯，且術(shù)后膝關(guān)節(jié)滑膜組織中炎性細(xì)胞因子IL-1β，IL-6，TNFα的表達(dá)水平明顯上調(diào)，說(shuō)明炎性因子參與到骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展過(guò)程中。
　　3、DMM手術(shù)后小鼠血清及脾臟B淋巴細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子明顯升高。
　　將CON小鼠分為DMM手術(shù)組(DMM group)和假手術(shù)組(SHAM group)。分別于術(shù)

8、后4周和8周取兩組小鼠的血清，并從脾臟細(xì)胞中分離得到B淋巴細(xì)胞。利用ELISA技術(shù)分析血清中炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)DMM手術(shù)組血清中炎性因子的表達(dá)水平相對(duì)于假手術(shù)組有所升高。除此之外，利用qPCR技術(shù)分析從脾臟細(xì)胞中分離所得的B淋巴細(xì)胞中炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα的表達(dá)，qPCR結(jié)果顯示DMM手術(shù)組與假手術(shù)組相比較B細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)水平明顯升高。證實(shí)了炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα

9、確實(shí)在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。
　　4、KO小鼠與CON小鼠相比炎性因子的表達(dá)有所不同。
　　于KO小鼠及CON小鼠出生后16周，取二者的脾臟分離得到B淋巴細(xì)胞，并取膝關(guān)節(jié)滑膜。利用qPCR技術(shù)分析KO小鼠和CON小鼠B淋巴細(xì)胞及滑膜中炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα的表達(dá)情況。qPCR結(jié)果分析顯示成年后兩種小鼠膝關(guān)節(jié)滑膜中炎性因子的表達(dá)無(wú)明顯差異，但KO小鼠的B淋巴細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)相對(duì)于CON

10、小鼠有明顯升高。通過(guò)此結(jié)果我們做出假設(shè)，由于B淋巴細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)增加，KO小鼠或許能表現(xiàn)出更為明顯的骨關(guān)節(jié)炎表型。
　　5、KO小鼠表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)炎表型。
　　基于上述假設(shè)，我們選取8周齡的雄性KO小鼠及CON小鼠構(gòu)建DMM骨關(guān)節(jié)炎模型。并于術(shù)后4周及8周取膝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織切片，同時(shí)取關(guān)節(jié)軟骨用液氮研磨后用TRIZOL裂解以便提取RNA。膝關(guān)節(jié)Safranin-O/Fast Green染色結(jié)果顯示術(shù)后4周，8周K

11、O小鼠關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖丟失明顯且磨損嚴(yán)重，modified Mankin評(píng)分KO小鼠高于CON小鼠。toluidine blue染色結(jié)果表明KO小鼠關(guān)節(jié)軟骨厚度明顯低于CON小鼠。膝關(guān)節(jié)MMP-13免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示KO小鼠陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于CON小鼠。關(guān)節(jié)軟骨qPCR結(jié)果顯示KO小鼠關(guān)節(jié)軟骨中二型膠原含量明顯降低而十型膠原含量明顯升高。上述結(jié)果均證實(shí)了之前的假設(shè)，說(shuō)明KO小鼠相對(duì)于CON小鼠在構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎模型后表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的骨關(guān)

12、節(jié)炎表型。
　　6、構(gòu)建DMM模型后KO小鼠表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。
　　除了上述組織切片的分析外，在術(shù)后4周和8周我們分別取了KO小鼠和CON小鼠的血清及關(guān)節(jié)滑膜。通過(guò)ELISA分析血清中炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)KO小鼠血清中炎性因子的表達(dá)水平要高于CON小鼠。利用qPCR技術(shù)分析膝關(guān)節(jié)滑膜中炎性因子的表達(dá)情況我們同樣發(fā)現(xiàn)炎性因子在KO小鼠膝關(guān)節(jié)滑膜中的水平要高于CON小鼠。上述結(jié)果進(jìn)一

13、步證實(shí)了KO小鼠骨關(guān)節(jié)炎程度重于CON小鼠且KO小鼠表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　(1)成功構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細(xì)胞特異性敲除mTORC1的上游抑制組分TSC1的小鼠模型。
　　(2)利用同窩對(duì)照小鼠驗(yàn)證了DMM手術(shù)構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎模型的有效性。
　　(3)通過(guò)DMM手術(shù)組與假手術(shù)組的對(duì)比驗(yàn)證了炎性因子確實(shí)參與到骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過(guò)程中。
　　(4)比較KO小鼠與CON小鼠發(fā)現(xiàn)在正常狀態(tài)下二者膝關(guān)節(jié)