檸檬醛對雞胚唇部組織形態(tài)發(fā)育和成纖維細胞生長因子8時空表達的影響.pdf

1、目的：本研究通過載體微珠將檸檬醛植入正常發(fā)育的20期雞胚鼻窩組織中，建立雞胚唇裂模型;制備地高辛標記的成纖維細胞生長因子8(FGF8) RNA探針，通過整胚原位雜交的方法檢測雞胚唇部發(fā)育和唇裂發(fā)生過程中FGF8基因時空表達的變化，探索FGF8在唇裂發(fā)生中機理，為早期發(fā)現(xiàn)預防唇裂提供理論依據(jù)。
　　方法：1.FGF8 RNA探針的制備本實驗應用Marion Wassef PhD惠贈的雞FGF8/pBluescript KSⅡ(+)重

2、組質(zhì)粒，EcoRⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切得到線性化DNA模板，利用pBluescript KSⅡ(+)載體中的T3、T7RNA聚合酶上的啟動子，體外轉(zhuǎn)錄合成地高辛標記的FGF8正、反義RNA探針。探針的合成為后續(xù)的整胚原位雜交試驗做好了準備。
　　2.各個時期雞胚的收集將正常發(fā)育的20期雞胚隨機分為3組，分別是實驗組、陰性對照組、正?？瞻讓φ战M。實驗組（CT組）:20期雞胚右側(cè)鼻窩外胚層上植入攜帶0.6g/mL濃度的檸檬醛微珠

3、;陰性對照組(DMSO組):20期雞胚右側(cè)鼻窩外胚層植入浸泡于DMSO中的微珠;空白對照組:20期雞胚未經(jīng)任何處理。3組分別收集20期至28期每期5只雞胚。
　　3.整胚原位雜交檢測FGF8基因mRNA的時空表達通過整胚原位雜交的方法檢測雞胚唇部發(fā)育和唇裂發(fā)生過程中FGF8基因的時空表達變化。
　　結(jié)果：1、體外成功轉(zhuǎn)錄獲得正、反義雞的FGF8 RNA探針。
　　2、正常組、DMSO組和CT組正常側(cè)三者唇部發(fā)育無明顯差

4、別。正常組、DMSO組和CT組正常側(cè)雞胚20期微珠植入1h后，鼻板凹陷形成淺窩;22期時面部各突起已經(jīng)形成，由額鼻突、側(cè)鼻突、上頜突圍成鼻窩;24期內(nèi)外側(cè)鼻突與上頜突圍成的鼻縫較寬，并與下頜突一起圍成了口凹;隨時間推移，各突起逐漸發(fā)育并接觸融合，兩側(cè)對稱邊緣連續(xù)。20期+1h CT組實驗側(cè)未觀察到明顯異常;22期開始觀察到上頜突、側(cè)鼻突出現(xiàn)發(fā)育異常，上頜突及內(nèi)外側(cè)鼻突發(fā)育缺損，體積較正常組明顯縮小，突起融合發(fā)生障礙。
　　3、FG

5、F8的表達在雞胚頜面部呈動態(tài)性，正常組、DMSO組和CT組正常側(cè)三者頜面部FGF8的表達無明顯差別。正常組、DMSO組和CT組正常側(cè)中可觀察到20期+1h時FGF8在額鼻區(qū)和鼻窩內(nèi)側(cè)邊緣廣泛高表達，上頜突的下緣和尾端及下頜突的外側(cè)上緣也呈高表達;隨著頜面部的發(fā)育，22期FGF8的表達局限在額鼻突中央、內(nèi)側(cè)鼻突、上頜突下緣及下頜突的上緣;內(nèi)側(cè)鼻突的表達在24期擴展至外側(cè)鼻突，額鼻突中央及下頜突表達消失;24期后FGF8的表達開始下降，28

6、期FGF8在突起接觸融合處表達明顯降低甚至消失。20期+1h CT組實驗側(cè)FGF8的表達未觀察到明顯異常;22期至24期側(cè)鼻突FGF8的表達較正常組、DMSO組和CT組正常側(cè)下降;26期及28期側(cè)鼻突與上頜突融合處FGF8的表達較正常組、DMSO組和CT組正常側(cè)高。
　　結(jié)論：1、制備的FGF8反義RNA探針具有較高的特異性，能有效的檢測FGF8基因的表達。
　　2、檸檬醛可影響雞胚唇部組織FGF8的表達，F(xiàn)GF8表達的變化