基于單細胞轉錄組測序技術尋找t(821)急性髓系白血病預后相關基因及其異質性研究.pdf

1、目的:我國現已成為惡性腫瘤發(fā)病大國，其中成人白血病患者的死亡率高居首位。目前我國白血病發(fā)病率和死亡率具有逐年升高趨勢，每年新發(fā)白血病例約為5萬人，其高昂的診療費用給社會和患者家庭帶來極為沉重的經濟負擔。在急性白血病中，急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)屬于一類高度異質性的高侵襲性血液病，其發(fā)病主要由于髓系細胞分化成熟障礙和惡性克隆性增殖所引起。在AML中，最常見的染色體易位之一為t(8;21)(q22

2、;q22)，形成AML1-ETO融合基因。臨床診療中發(fā)現，約有60％的t(8;21)AML患者預后良好，另40％患者預后很差，在臨床和基礎研究中發(fā)現的高度異質性影響了t(8;21)AML的準確預后分層評估，這是干擾這類白血病診療的最關鍵問題之一。因此，發(fā)現新的預后相關分子生物學標志物，并進行精準預后分層對于這類患者的改善預后和提高療效具有十分重要的意義。目前該疾病的預后相關分子生物學標志物的研究尚不清楚，而單細胞轉錄組測序技術在研究腫瘤

3、異質性方面具有很大優(yōu)勢。因此，本研究在AML1-ETO陽性的t(8;21)AML患者中，應用單細胞轉錄組測序技術進行測序、生物信息學分析以及預后相關基因篩選，旨在研究單細胞轉錄組測序技術對t(8;21)AML異質性研究的價值，并尋找新的分子生物學標志物作為可靠的預后相關基因，最終為AML的精準診療提供潛在新靶點。
　　方法:本項目選取了3位AML1-ETO陽性的t(8;21)AML初治和復發(fā)患者，應用單細胞轉錄組測序技術，對患者外

4、周血或骨髓樣本中共計193例單細胞進行轉錄組測序，并應用實時熒光定量PCR法鑒別AML1-ETO陽性和陰性的單細胞樣本。對原始數據進行預處理后，應用非監(jiān)督聚類分析法和主成分分析法得到不同預后的亞克隆;應用加權共表達網絡分析法(Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA)尋找不同功能的基因模塊;應用層次聚類法研究各模塊的相關性，探索細胞類群與共表達模塊之間的功能關系。然后通過對單細

5、胞樣本的基因表達水平分析，從差異基因的表達分析、差異基因表達水平的層次聚類、基因熱圖的分析、差異基因的KEGG富集分析及GO分析等方面進行深入研究，獲得部分預后相關的差異基因。再結合患者臨床信息，篩選預后不良基因和預后良好基因，并在TCGA數據庫中選取329例AML患者和50例CBFβ-MYH11陽性AML患者，將預后相關基因在大樣本中進行生存分析。最終，通過在AML1-ETO陽性、陰性細胞系和正常人骨髓樣本中的驗證，確定t(8，21)

6、AML中與預后顯著相關的基因，為其精準預后分層和潛在的基因治療新靶點提供理論和實踐依據。
　　結果:實時熒光定量PCR法共鑒別出89例AML1-ETO陽性和16例AML1-ETO陰性單細胞樣本。原始的單細胞轉錄組數據經過數據預處理、質量控制和與參考基因組比對后，獲得Mapped Reads在1million以上符合分析標準的為58例AML1-ETO陽性單細胞樣本和12例AML1-ETO陰性單細胞樣本。應用非監(jiān)督聚類分析法和主成分分

7、析法，在10220個基因的基礎上將58例AML1-ETO陽性的單細胞樣本分為預后低危、中危和高危共三大預后分層，低危亞克隆A和C、中危亞克隆B和E和高危亞克隆D共5類亞克隆，證明t(8;21)AML具有高度異質性。應用WGCNA法，在AML1-ETO陽性的單細胞樣本中發(fā)現許多功能不同的基因模塊;通過對各模塊相關性分析，發(fā)現基因功能性相關的5個細胞類群，各細胞類群內部均有較高同質性，均可獨自構成基因功能相關性較高的亞群。在細胞類群與共表達

8、模塊的功能關系分析中，不同的基因模塊在不同的細胞類群中表達水平有明顯差異，證實了主成分分析法和WGCNA法結果的可靠性。在單細胞樣本的基因表達水平分析中，分別從差異基因的表達分析、差異基因表達水平的層次聚類、基因的熱圖分析、差異基因的KEGG富集分析及GO分析等進行研究后，獲得了預后相關的差異基因，并證明雖同樣罹患t(8;21)AML，但不同患者間、不同預后分層間、不同危險度亞克隆的AML1-ETO陽性樣本間均存在高度異質性，同時證明A

9、ML1-ETO陽性和陰性樣本間也存在高度異質性。結合患者臨床信息，共篩選出563個預后不良基因和491個預后良好基因，并在TCGA數據庫中的329例AML患者和50例CBFβ-MYH11陽性AML患者進行生存分析，結果獲得預后不良基因LPCAT2、SNAP47和預后良好基因TAS2R14。最終通過3種基因在AML1-ETO陽性細胞系（Kasumi-1和SKNO-1）、AML1-ETO陰性細胞系(HL-60和SKNO-1-siA/E)和正

10、常人骨髓樣本中的驗證，確定了t(8，21)AML的預后良好基因TAS2R14。本研究為t(8，21)AML的精準預后分層和潛在基因治療新靶點提供了理論和實踐依據。
　　結論:單細胞轉錄組測序技術在血液系統(tǒng)惡性腫瘤異質性的研究方面具有極大優(yōu)勢。本研究通過深入探索單細胞轉錄組測序技術在t(8;21)AML中的應用，證實可通過該技術研究該疾病的異質性，為AML發(fā)生發(fā)展的分子生物學研究提供了重要依據。同時，該技術可精確提供t(8;21)A