HLA-DRB1-0803轉基因載體構建及表達功能的研究.pdf

1、目的:
　　由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致的乙型肝炎是一種嚴重危害人類健康的傳染病，不僅在世界范圍內感染人數(shù)眾多，而且容易發(fā)展成為肝硬化和肝癌。雖然乙肝疫苗的成功應用使新發(fā)的HBV感染數(shù)量有所下降，但目前全世界仍有3.5億慢性乙肝病毒感染者，核苷類似物和干擾素或許可以使部分患者的血清學指標轉陰，但不能徹底清除肝細胞內部的病毒。相對于HCV和其他一些嗜肝病毒來說，目前人們還沒有找到一種可以徹底治愈HBV感染的辦法。
　　為了

2、研究HBV的感染致病機制和研發(fā)防治藥物，人們迫切需要構建一個合適的動物模型，但由于HBV有明顯的嗜肝性，且宿主范圍狹窄，體外培養(yǎng)困難，使HBV動物模型的選擇方面受到了很大限制。近年來，人們嘗試建立了多種HBV動物模型，如大鼠、樹鼩、人-小鼠嵌合肝模型等，但均有各自的不足，其中一個共同的缺點即是，無法模擬人體對HBV感染產生特異性的免疫應答。
　　人類白細胞抗原(HLA)的高度多態(tài)性是造成宿主感染HBV的結局異同的主要原因。前期的G

3、WAS研究結果表明，HLA的DRB1*0803等位可能在慢性乙型肝炎的感染過程中起到了保護作用。為了進一步研究HLA-DRB1*0803的保護效應及遺傳免疫學機制，擬構建HLA-DRB1*0803轉基因人源化免疫小鼠模型。
　　本研究構建了包含小鼠MHC-Ⅱ類分子組織特異性表達調控元件的HLA-DRB1*0803轉基因載體，并在體外和體內分別進行了表達功能驗證和轉基因鼠模型構建。
　　方法:
　　提取WATANABE細

4、胞（基因型為DRB1*0803純合子）的總RNA，逆轉錄得到cDNA，PCR擴增出DRB1*0803基因片段。在NCBI上查找到小鼠Eα promoter和兔β-globin的基因序列，用重疊PCR的方法化學合成。將上述3段基因按順序連接到pBR002-1acz載體上。測序驗證無誤后，成功構建表達載體HLA-DRB1*0803。使用Lipofectamine2000轉染試劑盒將該載體轉染至小鼠DCS細胞和B細胞系，用WesternBlo

5、t和免疫熒光的方法對目的蛋白進行檢測。用T細胞增殖的方法檢測該載體轉染后的細胞是否可以將抗原遞呈給人的T細胞，啟動MHC-Ⅱ類限制性的CD4+ Th1反應。用XbaⅠ內切酶切開質粒環(huán)，將含有目的基因的片段采用顯微注射的方法注射入FVB/N品系小鼠的受精卵內，制備F0代DRB1*0803轉基因小鼠，剪尾提取DNA后用PCR的方法進行篩選。
　　結果:
　　1.經(jīng)全自動序列分析儀測序驗證，成功擴增、克隆了人類HLA-DRB1*0

6、803基因，構建了HLA-DRB1*0803表達載體。
　　2.經(jīng)HLA-DRB1*0803轉基因載體轉染后，小鼠DCS細胞和B細胞系的WesternBlot分析結果均表達出了大小約為29KDa的目的蛋白。
　　3.免疫熒光結果表明，轉染后DCS細胞的胞漿和胞膜上可見特異性蛋白表達。
　　4.T細胞增殖實驗表明，轉染后的小鼠DCS細胞可將負載的HBcAg遞呈給人的T細胞，產生特異的T細胞免疫應答。
　　5.篩選出