重組sCT-CGRP基因轉(zhuǎn)生菜體系的建立及表達的研究.pdf

1、心血管疾病與骨質(zhì)疏松癥正威脅著人類的生命健康,尤其給老年人的生活帶來嚴(yán)重影響。目前治療兩種疾病的有效藥物分別是降鈣素基因相關(guān)肽(haCGRP)和鮭魚降鈣素(sCT),但目前臨床用haCGRP與sCT主要是通過組織提取或化學(xué)合成的方法獲得,存在來源有限和價格昂貴等問題。
　　 本課題為了滿足同時預(yù)防和治療心血管疾病與骨質(zhì)疏松癥的要求,應(yīng)用基因工程技術(shù)對重組鮭魚降鈣素與降鈣素基因相關(guān)肽(msCT-haCGRP)融合基因進行了研究,并

2、已成功將msCT-haCGRP融合基因整合到植物雙元表達載體中。研究擬利用生菜作為表達系統(tǒng)來表達該融合基因。
　　 選擇美國大速生生菜品種,通過對再生體系的優(yōu)化,獲得最優(yōu)再生條件:8％次氯酸鈉對種子消毒滅菌30 min,播種于1／2 MS無菌培養(yǎng)基,取苗天數(shù)7 d,子葉柄為受體材料,正面朝上接入不定芽分化培養(yǎng)基。
　　 利用本實驗室構(gòu)建的重組基因工程菌株pBI AMV／haCGRP／msCT EHA105,通過對遺傳轉(zhuǎn)化

3、體系的優(yōu)化,獲得最佳轉(zhuǎn)化條件:篩選分化培養(yǎng)基中Cefx濃度500 mg／L,Kan濃度25 mg／L,轉(zhuǎn)化過程預(yù)培養(yǎng)2 d,菌液濃度OD600值0.1,侵染時間5 min。
　　 選擇10株轉(zhuǎn)基因抗性生菜進行擴大繁殖,對后代植株提取基因組DNA進行PCR檢測,發(fā)現(xiàn)有8株表現(xiàn)為陽性,轉(zhuǎn)基因陽性率為80％。選擇一株陽性植株提取融合基因進行DNA序列測定,結(jié)果表明已成功將msCT-haCGRP融合基因?qū)肷嘶蚪M中,獲得了具有保健和