P12 CDK2-AP1與CD82相互作用對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞OSCC-15及裸鼠移植瘤生長(zhǎng)作用的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)之間相互作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，本課題組與西北工業(yè)大學(xué)自動(dòng)化學(xué)院張紹武教授、陳偉博士團(tuán)隊(duì)合作，利用計(jì)算機(jī)基于蛋白質(zhì)氨基酸序列自相關(guān)函數(shù)及PPI-PKSVM模板的方法，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證與p12CDK2-AP1蛋白可能相結(jié)合的CD82蛋白，并通過(guò)免疫共沉淀Co-IP的方法進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物體內(nèi)移植瘤等實(shí)驗(yàn)探討p12CDK2-AP1蛋白與CD82相結(jié)合后對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞OSCC-15的作用機(jī)制。
　　目的：

2、　　1．利用基于蛋白質(zhì)氨基酸序列自相關(guān)函數(shù)的計(jì)算機(jī)方法預(yù)測(cè)p12CDK2-AP1與其相互作用的蛋白，并使用計(jì)算機(jī)相關(guān)模板PPI-PKSVM進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2．利用Co-IP實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證p12CDK2-AP1與CD82相互作用結(jié)果。
　　3．探討p12CDK2-AP1與CD82相結(jié)合后對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞OSCC-15生物學(xué)行為的影響。
　　4．通過(guò)裸鼠移植瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討p12CDK2-AP1和CD82蛋白相結(jié)合后在體內(nèi)對(duì)腫瘤

3、發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)作用。
　　方法：
　　1．使用基于蛋白質(zhì)氨基酸序列自相關(guān)函數(shù)的計(jì)算機(jī)方法和PPI-PKSVM計(jì)算機(jī)模板技術(shù)預(yù)測(cè)并驗(yàn)證與p12CDK2-AP1蛋白可能相結(jié)合的蛋白。
　　2．利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建pIRES2-EGFP-p12CDK2-AP1和pIRES2-EGFP-CD82真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　3．將pIRES2-EGFP-p12CDK2-AP1和pIRES2-EGFP-CD82質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至29

4、3T及OSCC-15細(xì)胞中，培養(yǎng)0，12，24，48，72小時(shí)后，Western blot觀察表達(dá)情況并確定表達(dá)效率最高時(shí)間。利用免疫共沉淀Co-IP方法，初步驗(yàn)證p12CDK2-AP1與CD82在真核細(xì)胞中存在相互作用。
　　4．共同過(guò)表達(dá)p12CDK2-AP1，CD82基因于OSCC-15細(xì)胞，利用MTT實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)其對(duì)OSCC-15細(xì)胞增殖的影響；利用Transwell小室檢測(cè)其對(duì)OSCC-15細(xì)胞侵襲的影響；利用Annex

5、in V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)對(duì)OSCC-15細(xì)胞凋亡的影響。
　　5．共同過(guò)表達(dá)p12CDK2-AP1，CD82基因于OSCC-15細(xì)胞后，注射于裸鼠右前肢腋下皮內(nèi)，以未轉(zhuǎn)染的OSCC-15細(xì)胞為空白對(duì)照組，OSCC-15細(xì)胞/NC(空白質(zhì)粒)為陰性對(duì)照組，注射后7天出現(xiàn)腫瘤，每3天測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑和最短徑，直至注射后25天。計(jì)算腫瘤的體積和各組腫瘤的抑制率。
　　結(jié)果：
　　1.使用自相關(guān)函數(shù)計(jì)算技術(shù)預(yù)測(cè)

6、與p12CDK2-AP1相結(jié)合的10種蛋白。p12CDK2-AP1和CD82氨基酸序列輸入PPI-PKSVM計(jì)算機(jī)模板，驗(yàn)證p12CDK2-AP1與CD82能夠結(jié)合。
　　2.成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-p12CDK2-AP1和pIRES2-EGFP-CD82真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　3.過(guò)表達(dá)p12CDK2-AP1和CD82基因于293T細(xì)胞中，并通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了p12CDK2-AP1與CD82存在相互作用。

7、　　4.分別過(guò)表達(dá)p12CDK2-AP1，CD82基因及p12CDK2-AP1/CD82基因組于OSCC-15細(xì)胞后，p12CDK2-AP1/CD82組相比其他組對(duì) OSCC-15細(xì)胞增殖和侵襲能力有明顯的抑制作用，且明顯促進(jìn)對(duì)OSCC-15細(xì)胞的凋亡作用。
　　5.裸鼠移植瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p12CDK2-AP1/CD82基因后可明顯減小轉(zhuǎn)移瘤大小。
　　結(jié)論：
　　本研究首先應(yīng)用自相關(guān)函數(shù)計(jì)算方法及PPI-PK