經(jīng)APTES共價修飾后的細胞膜色譜新技術(shù)的研發(fā)及應(yīng)用.pdf

1、細胞膜色譜(Cell Membrane Chromatography，CMC)是一種將細胞膜提取后鍵合到固定相表面的生物色譜，它結(jié)合了生物材料的生物學(xué)活性以及傳統(tǒng)分析色譜法在線分離、高通量的優(yōu)勢，使得從中藥等復(fù)雜體系中篩選出有效的活性成分成為可能，而且更加高效、便利。中藥具有整體性、復(fù)雜性的特點，這些特點賦予了它多靶點、多途徑調(diào)節(jié)的優(yōu)勢和特色。然而，正是由于這些特性，導(dǎo)致中藥中的主要活性成分并不明確，其作用效果和現(xiàn)代理論基礎(chǔ)也較為薄弱，

2、主要的臨床應(yīng)用仍舊依賴幾千年來無數(shù)中醫(yī)前輩所積累的經(jīng)驗所推理得到的富含辯證關(guān)系的中醫(yī)理論。細胞膜色譜作為一種新興的生物色譜技術(shù)，在中藥活性篩選的研究領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用。本研究在原有細胞膜色譜模型基礎(chǔ)之上進行了創(chuàng)新，研發(fā)出一種新型的經(jīng)APTES修飾后的細胞膜色譜模型，并對新型細胞膜色的模型的方法學(xué)進行了考察和優(yōu)化，在中藥活性成分篩選領(lǐng)域內(nèi)多方面開展了應(yīng)用研究，從而為細胞膜色譜制備的進一步科學(xué)化、規(guī)范化、合理化提供依據(jù)，并有利于進一步

3、拓展細胞膜色譜的應(yīng)用范圍。
　　1.新型經(jīng)APTES修飾的細胞膜色譜方法學(xué)的建立及考察
　　細胞膜色譜是一種新型的生物親合色譜，該模型使用特定細胞膜鍵合于硅膠上作為色譜固定相。但是細胞膜色譜存在壽命較短，易失活等問題，一直以來影響細胞膜色譜的普及。除此以外，由于不同實驗室制備條件不一致，還存在重現(xiàn)性較差的問題。因此本章針對細胞膜色譜柱壽命較短的問題，創(chuàng)新性地采用了一種新型的經(jīng)過（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷((3-aminop

4、ropyl)triethoxysilane，APTES）共價修飾后的硅膠應(yīng)用到了細胞膜色譜的制備過程中。本研究首次提出使用共價修飾的方法，研發(fā)新型的細胞膜色譜技術(shù)。其原理就是利用APTES作為橋梁，在硅膠表面鍵合了醛基，該醛基可以與細胞膜上豐富的氨基基團以共價鍵的形式結(jié)合。通過這種方式，細胞膜和硅膠間的結(jié)合力將會極大增強，從而使得細胞膜的脫落失活現(xiàn)象得到一定程度的緩解。經(jīng)實驗考察，所制備的新型的經(jīng)APTES共價修飾的細胞膜色譜柱可以具有

5、更高的柱效和更長的壽命，從原有的不足3天提高到現(xiàn)在的12天左右。為了解決重現(xiàn)性較差的問題，本研究還對新建立的經(jīng)APTES共價修飾的細胞膜色譜法進行了方法學(xué)考察，對細胞膜色譜制備過程的關(guān)鍵步驟進行了考察，如細胞量、細胞破碎條件等，并制定了相應(yīng)的用量標準和操作規(guī)程。
　　2.經(jīng)APTES修飾的MCF7全二維細胞膜色譜的構(gòu)建及其應(yīng)用
　　為進一步擴展在第一章基礎(chǔ)上所搭建好的經(jīng)共價修飾后的新型細胞膜色譜模型的應(yīng)用，并探索闡明中藥元胡

6、的抗癌作用機制，篩選中藥元胡中的潛在抗癌活性成分或者藥物前體，在本章中，擬選用元胡作為中藥材的研究對象，通過使用MCF7細胞系構(gòu)建經(jīng)APTES修飾的MCF7細胞膜色譜，在線對元胡提取液中的各組分進行高通量篩選。在確保APTES修飾的2D MCF7/CMC-C18柱/TOF-MS系統(tǒng)的穩(wěn)定性、選擇性的基礎(chǔ)上，我們從中藥元胡中篩選鑒別到了3種潛在活性化合物，即氧海罌粟堿、普魯托品、小檗堿。這三種活性成分可以有效地對MCF7細胞進行濃度依賴性

7、的殺傷，其在MCF7細胞中的IC50值分別為36.16μM、29.30μM和45.52μM;且經(jīng)過細胞凋亡和死亡實驗進行考察后發(fā)現(xiàn)，這三種活性成分主要是通過誘導(dǎo)細胞凋亡來發(fā)揮藥效的。本研究結(jié)果表明所構(gòu)建的經(jīng)APTES修飾后的2D MCF7/CMC-C18柱/TOF-MS系統(tǒng)是一種用于中藥抗乳腺癌活性成分篩選的可行方法。
　　3.經(jīng)APTES修飾的DU145全二維細胞膜色譜的構(gòu)建及其應(yīng)用
　　為進一步確證經(jīng)共價修飾后的新型細胞

8、膜色譜模型的有效性，從而為細胞膜色譜的進一步發(fā)展應(yīng)用探索道路，本章在第一章、第二章基礎(chǔ)上所搭建好的經(jīng)共價修飾后的新型細胞膜色譜模型基礎(chǔ)上，探索篩選中藥元大黃、黃芩中的潛在抗癌活性成分或者藥物前體。在本章中，擬選用大黃和黃芩作為中藥材的研究對象，通過使用經(jīng)APTES修飾后的硅膠，構(gòu)建了2D DU145/CMC-C18柱/TOF-MS系統(tǒng)，在線對大黃和黃芩提取液中的各組分進行高通量篩選。在確證經(jīng)APTES修飾的2DDU145/CMC-C18

9、柱/TOF-MS系統(tǒng)的選擇性、適用性的基礎(chǔ)上，我們從中藥大黃和黃芩中篩選鑒別到了三種潛在活性化合物，即木蝴蝶素A、丹葉大黃素和大黃素。經(jīng)過細胞增殖實驗的考察，發(fā)現(xiàn)這三種活性成分均可以有效地對DU145細胞進行濃度依賴性的殺傷，其在DU145中的IC50分別為151.1μM、55.66μM和85.81μM;且經(jīng)過細胞凋亡和死亡實驗進行考察后，進一步確證了這三種活性成分的藥效，并發(fā)現(xiàn)其藥效作用主要是通過誘導(dǎo)細胞凋亡來發(fā)揮藥效的。本研究結(jié)果表

10、明所構(gòu)建的經(jīng) APTES修飾后的2D DU145/CMC-C18柱/TOF-MS分析系統(tǒng)是一種從中藥中篩選抗前列腺癌活性成分的可行方法。
　　4.經(jīng)APTES修飾的全二維HepG2干細胞膜色譜系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng)用
　　最近一段時間，腫瘤干細胞的研究在抗癌研究領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注。它們是一類具有自我更新能力的特殊腫瘤細胞，在腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和遷移中發(fā)揮著重要作用。殺死腫瘤干細胞將會顯著提高腫瘤的治愈率，同時也能大大降低腫瘤的

11、復(fù)發(fā)率。但是通常來說分離和培養(yǎng)腫瘤干細胞是十分困難且耗時的過程，獲得足夠量的腫瘤干細胞進行相關(guān)研究時，對我們的實驗要求也更高、更苛刻。而我們新建立的APTES修飾的細胞膜色譜壽命長、效率高，恰好十分適用于腫瘤干細胞。因此在本研究中，我們通過APTES修飾的硅膠建立了一種新的HepG2-CSC/CMC，并選擇一種著名的中藥丹參（Salvia miltiorrhiza，其炮制部位為唇形科植物丹參的干燥根和根莖）作為理想的中藥復(fù)雜體系進行活性

12、成分篩選。有報道研究證明，在1981至2006年之間，臨床上70％的新批藥物來源于天然產(chǎn)物。因此從中藥中篩選出潛在的具有抗腫瘤干細胞的活性成分是一項很有前景的研究。此外，根據(jù)本課題組的前期研究報道，我們還擬采用全二維色譜法，以進一步提高CMC的分離度。在這些條件下，本研究搭建了一個經(jīng)APTES共價修飾的HepG2腫瘤干細胞細胞膜色譜全二維分析系統(tǒng)，對丹參中的活性成分進行了篩選，得到了丹參酮IIA、隱丹參酮、二氫丹參酮I這三種潛在活性成分

13、。結(jié)合后期的細胞增殖抑制實驗考察得到其IC50值分別為10.300μM，17.850μM，2.53μM，然后通過細胞凋亡實驗進一步確證其藥效，并利用虛擬對接技術(shù)，確證其潛在藥效作用靶點可能為細胞膜上的VEGFR。使用經(jīng)APTES修飾的硅膠構(gòu)建的全二維細胞膜色譜是一種有效的從復(fù)雜體系（如中藥等）中篩選具有潛在抗癌活性的目標化合物的新方法，特別是對于一些珍稀的、較難以獲得的生物材料。
　　總之，針對細胞膜色譜應(yīng)用過程中所面臨的柱壽命短

14、、穩(wěn)定性差的問題，本課題通過對硅膠表面進行共價修飾，創(chuàng)新性地利用APTES在硅膠表面鍵和醛基從而與細胞膜表面大量的游離氨基形成共價鍵，首次通過共價修飾的方式延長了細胞膜色譜柱壽命并提高其穩(wěn)定性。后續(xù)系統(tǒng)考察優(yōu)化了細胞膜色譜制備方法學(xué)，制訂了一系列標準，從而保證新搭建的細胞膜色譜模型的重現(xiàn)性。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建新型MCF7、DU145和HepG2干細胞的全二維細胞膜色譜分析系統(tǒng)應(yīng)用于中藥抗腫瘤活性組分的篩選，大大提升了通量，篩選到抗乳腺癌、抗