碳青霉烯類耐藥菌NDM-1質(zhì)粒獲取的危險因素和周圍基因環(huán)境研究.pdf

1、目的：
　　區(qū)域性播散是造成質(zhì)粒編碼NDM-1酶(New Delhi metallo-β-lactamase1,即新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1)廣泛流行的主要原因，然而其相關(guān)的危險因素和基因周圍環(huán)境尚未見系統(tǒng)性報道。本研究通過收集篩選我院產(chǎn)NDM-1酶的碳青霉烯耐藥菌，在調(diào)查blaNDM-1基因的流行狀況的基礎(chǔ)上，對含NDM-1基因耐藥菌株感染的臨床危險因素與預后進行分析，提取含blaNDM-1基因的質(zhì)粒進行全基因組測序和生物信息

2、學分析研究，系統(tǒng)探討 NDM-1基因的流行狀況，blaNDM-1基因耐藥菌株的影響因素和預后，進一步分析質(zhì)粒中NDM-1的基因周圍環(huán)境，并與國內(nèi)外相關(guān)研究進行比較。對揭示 NDM-1耐藥基因的流行、易感因素和進化趨勢具有重要意義。為制訂科學、有效的預防和控制措施提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、收集和篩選我院臨床標本中對碳青霉烯類抗生素不敏感的革蘭氏陰性桿菌（剔除同一患者同一部位的重復菌株），應(yīng)用PCR技術(shù)進行blaNDM

3、-1基因陽性標本篩查，將保存的鑒定為blaNDM-1基因陽性的混合菌液傳代培養(yǎng)，并將傳代培養(yǎng)的菌液行blaNDM-1基因篩查，由于分離的菌種數(shù)目多，菌種復雜，含有革蘭氏陽性和陰性細菌，應(yīng)用 BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定同時擴增細菌16srRNA進行測序，明確含blaNDM-1基因的菌種，應(yīng)用E-test法檢測菌株抗菌藥物敏感性、MIC值及金屬酶表型篩選實驗。通過耐藥性和金屬酶表型篩選實驗，獲得上述含blaNDM-1基因的耐藥菌

4、株數(shù)據(jù)，結(jié)合臨床資料進行分析。
　　2、運用病例對照研究方法，將含NDM-1酶細菌感染的患者為A組，另按l：1：1的比例配對，分離出碳青霉素類不敏感細菌（NDM-1基因陰性）的患者為B組和碳青霉烯類抗生素敏感的細菌的患者為C組進行研究，采用病歷信息收集回顧性研究的方法，制作調(diào)查表后查閱出院病歷，調(diào)查患者的住院科室、姓名、性別、年齡、住院時間、基礎(chǔ)疾病、危險因素、臨床結(jié)局等資料，通過單因素和多因素Logstic回歸分析碳青霉烯類耐藥

5、菌NDM-1質(zhì)粒獲取的危險因素。
　　3、質(zhì)粒接合試驗驗證blaNDM-1基因遺傳穩(wěn)定性，對于分離的能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因的菌株，Southern blot對blaNDM-1進行基因定位。提取質(zhì)粒DNA，將滿足要求（含有NDM-1基因）的5個質(zhì)粒分別構(gòu)建基因組測序文庫，將blaNDM-1質(zhì)粒進行高通量測序，對測序結(jié)果進行拼接及比對，進行質(zhì)粒gap的填補及差異序列驗證，并注釋質(zhì)粒系列的基因。將得到的質(zhì)粒序列輸入到NCBI在

6、線網(wǎng)站中進行Blast比對，利用Mauve軟件進行對比詳細查看不同點。
　　結(jié)果：
　　1、1735株碳青霉烯類抗生素不敏感細菌中，一共篩選到含blaNDM-1基因菌株54株，其中肺炎克雷伯菌中篩到陽性菌株44株，鮑曼不動桿菌株中篩到陽性菌株8株，大腸桿菌中篩到陽性菌株2株，blaNDM-1基因陽性菌株體外藥敏實驗顯示， blaNDM-1基因陽性菌株對大多數(shù)的抗生素的耐藥率都超過了50％，尤其是對耐碳青霉烯類抗生素耐藥率非常

7、高。改良Hodge實驗提示有1735株碳青霉烯抗生素不敏感菌株中出現(xiàn)512株陽性。54株blaNDM-1基因陽性菌株的臨床資料顯示其來自43位患者，住院科室主要分布在燒傷科、呼吸科、ICU；主要標本來源于痰液、尿液、血液。
　　2、A組和B組對絕大多數(shù)抗生素表現(xiàn)出非常高的耐藥率，C組對大部分抗生素的耐藥率均較低，其中A組與B組統(tǒng)計分析比較具有統(tǒng)計學差異的抗生素為亞胺培南、阿米卡星、左亞氟沙星；耐碳青霉素類抗生素菌株（A+B組）和對

8、碳青霉素類抗生素敏感菌株（C組）單因素分析，得出以下方面具有差異性：住院時間、分離出該菌株前兩個月內(nèi)應(yīng)用廣譜抗菌藥物大于7天、從外院轉(zhuǎn)入、分離出該菌株前14天內(nèi)使用過抗生素類藥物、發(fā)熱峰值（平均℃）、抗生素使用種類、治療中使用替加環(huán)素、好轉(zhuǎn)出院（%）、治療失敗（%）和自動出院（%），并進行多因素Logstic回歸分析得出分離出該菌株前兩個月內(nèi)應(yīng)用廣譜抗菌藥物大于7天和分離出該菌株前14天內(nèi)使用過抗生素類藥物是耐碳青霉烯類抗生素菌株的獨立

9、危險因素；對A組和B組進行單因素分析，既往使用碳青霉素類抗生素和發(fā)生感染到死亡的時間具有差異性，并進行多因素Logstic回歸分析得出既往使用碳青霉烯類抗生素史為碳青霉烯類耐藥菌NDM-1質(zhì)粒獲取的獨立危險因素。
　　3、含 blaNDM-1基因菌株直接提取的質(zhì)粒和大腸 J53菌株進行接合的質(zhì)粒，進行 Southern blot雜交顯色，均證實 blaNDM-1基因大部分存在于質(zhì)粒中，且含blaNDM-1基因菌株與大腸J53菌株進

10、行質(zhì)粒結(jié)合成功率為50%，提示攜帶NDM-1基因的質(zhì)?？梢愿咝У卦谀c桿菌科類細菌之間發(fā)生轉(zhuǎn)移，為細菌的耐藥流行播散提供了傳播載體。將5株經(jīng)接合實驗驗證的質(zhì)?；蚪M建庫成功后，進行質(zhì)粒測序質(zhì)量評價和基因組拼裝，共得到2個完整的質(zhì)粒基因組序列，即 p12和p11106。選取7個物種的相關(guān)質(zhì)粒序列，分別通過Mauve軟件與的質(zhì)粒序列做相似性圖。通過上述基因環(huán)境比較，發(fā)現(xiàn)：1、p11106和p12質(zhì)粒與pNDM-BTR非常相似；2、p11106

11、、p12質(zhì)粒和另外六個質(zhì)粒存在包含（orf00032-orf00043）20-30kb區(qū)域的差異；3、 NDM-1基因位于（orf00032-orf00043）的中間位置，區(qū)域的上端的有兩個tnpA基因，以及在其下游發(fā)現(xiàn)36kb區(qū)域的orf00052(tnpA)。
　　結(jié)論：
　　1、blaNDM-1基因在區(qū)域性醫(yī)院存在一定的耐藥流行，在我院以肺炎克雷伯桿菌為主；提示肺炎克雷伯桿菌在blaNDM-1基因的傳播過程中起到了重要

12、作用，可能是blaNDM-1基因的保存宿主；
　　2、碳青霉烯類耐藥菌 NDM-1質(zhì)粒獲取的危險因素為既往有碳青霉素類抗生素使用史；
　　3、p11106和p12質(zhì)?？赡芫哂衟NDM-BTR質(zhì)粒的特征，含NDM-1質(zhì)粒存在orf00032-orf00043差異性，且具有多態(tài)性，NDM-1基因位于orf00032-orf00043的中間位置，聯(lián)系上端的兩個tnpA基因和下游36kb區(qū)域的orf00052(tnpA)，提示NDM