HDAC2與乙?；痯53k320相互作用對卵巢癌細(xì)胞株skov3-ovcar3的影響.pdf

1、卵巢上皮性癌是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤之首。卵巢深居盆腔，卵巢上皮性癌起病比較隱匿。在初期階段，卵巢癌癥狀不典型，因此早期診斷很難。大約70％的病人在確診時已是 FIGO分期的III期或IV期，這樣5年生存率就很低。在全世界范圍內(nèi)，約有200000名婦女被診斷患有這種惡性腫瘤，每年有12500疾病相關(guān)死亡病例。這種疾病的高死亡率可以通過在疾病進(jìn)展期的晚期診斷解釋，通常伴有廣泛的腹膜腔轉(zhuǎn)移。盡管理想的腫瘤細(xì)胞

2、減滅術(shù)和鉑類聯(lián)合化療可以提高惡性腫瘤患者的預(yù)后，但是5年生存率仍然只有40％。
　　組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HATs)和組蛋白去乙酰化酶（HDACs）調(diào)控組蛋白乙?；DACs的病理活性和表達(dá)可以引起如癌癥、免疫紊亂和肌營養(yǎng)不良等嚴(yán)重疾病。去乙?；冈诎┌Y中的表達(dá)往往是失調(diào)的，HDACs的表達(dá)干擾細(xì)胞周期調(diào)控和分化。HDAC2常常在腫瘤中過度表達(dá)，而且HDAC2表達(dá)水平是臨床一個獨立的預(yù)后指標(biāo)。此外，在治療過程中監(jiān)測HDAC2表達(dá)可

3、作為組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi）療效標(biāo)志。
　　腫瘤抑制因子p53是HDAC2的目標(biāo)蛋白。大量的p53四聚體的目標(biāo)基因調(diào)控生長停滯、衰老和凋亡去抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄。此外，p53影響代謝過程和活性氧的產(chǎn)生。無論是由于TP53（人類p53編碼的基因）缺失和突變，或者是控制p53蛋白表達(dá)水平和活性的信號通路的改變，都導(dǎo)致了大多數(shù)腫瘤中存在異常的p53信號通路。翻譯后修飾包括磷酸化，乙?；?jīng)典泛素化，和小泛素化，影響p53并且調(diào)控它在

4、體內(nèi)的功能。p53與其他轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)因子的相互作用也調(diào)控p53的表達(dá)和活性。
　　最近研究表示，p53的功能和HDAC2之間存在緊密聯(lián)系。乙酰化是正常p53功能不可缺少的。一些研究表明，k320乙?；桥cp53信號通路相關(guān)的，而這個位點是HDAC2的作用靶點。最近表明，在結(jié)腸癌細(xì)胞中HDAC2蛋白去乙?；痯53的賴氨酸殘基k320。一個小泛素化的修飾物作用于HDAC2，接著HDAC2與p53之間的相互作用可以使原本乙酰化的p53

5、k320去乙酰化，減弱p53與DNA的結(jié)合能力，影響下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。k320位于p53與DNA的連接區(qū)域/四聚化結(jié)構(gòu)域的C-末端區(qū)域。由此發(fā)現(xiàn)p53蛋白的C-末端與HDAC2相互作用比N-末端部分更強(qiáng)烈。通過減少位于DNA結(jié)合域和p53四聚體結(jié)構(gòu)域的p53k320乙?；?，產(chǎn)生無活性的p53四聚體，使得p53 DNA結(jié)合能力顯著降低，從而強(qiáng)烈影響p53靶基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖或活化，最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。但 HDAC2與乙?；?/p>

6、 p53k320的相互作用是否對卵巢癌的發(fā)生發(fā)展存在作用仍不清楚。
　　目的:本研究在細(xì)胞水平對HDAC2、p53和乙?；痯53k320進(jìn)行研究，探討HDAC2的表達(dá)以及HDAC2與p53、乙?；痯53k320的相互作用對卵巢癌細(xì)胞株的影響。
　　材料和方法:
　　1.研究對象：卵巢癌細(xì)胞株 skov3、ovcar3兩株細(xì)胞來自鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院科研中心保存，兩株細(xì)胞培養(yǎng)均采用1640培養(yǎng)基（含10％滅活太牛血清、1

7、00U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素）在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為 skov3空白對照組、skov3+空 shRNA組、skov3+HDAC2shRNA1組、skov3+HDAC2shRNA2組、skov3+HDAC2shRNA3組、ovcar3空白對照組、ovcar3+空 shRNA組 ovcar3+HDAC2shRNA組、ovcar3+HDAC2shRNA2組、ovcar3+HDAC2shRNA3組。
　　

8、2.研究方法：采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染 shRNA進(jìn)入實驗組細(xì)胞，沉默HDAC2，使用Real time-PCR和Western blot檢測10組細(xì)胞中HDAC2蛋白和mRNA的表達(dá)，使用Western blot對p53、乙?；痯53k320蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，使用CCK8檢測細(xì)胞活力。
　　3.統(tǒng)計學(xué)方法：采用統(tǒng)計軟件 SPSS17.0分析數(shù)據(jù)。應(yīng)用單因素方差分析比較實驗組中HDAC2 mRNA的表達(dá)水平，組間兩兩比較采用LS

9、D法。應(yīng)用單因素方差分析比較實驗組中HDAC2、p53、乙?；痯53k320蛋白表達(dá)水平，組間兩兩比較采用LSD法。檢驗水準(zhǔn)采用α=0.05，組間兩兩比較時檢驗水準(zhǔn)采用α′=α/比較次數(shù)=0.0167。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染48h后，與空白對照組、陰性對照組比較，HDAC2shRNA1組和HDAC2shRNA2 HDAC2表達(dá)量降低，并且差異有顯著性。
　　2.轉(zhuǎn)染48h后，實驗組與空白對照組，陰性對照組比較，p5

10、3表達(dá)升高，差異有顯著性,同時，HDAC2shRNA組乙?；?p53k320蛋白表達(dá)降低，與空白對照組，陰性對照組比較差異有顯著性，陰性對照組與空白對照組之間的差異無顯著性。轉(zhuǎn)染48h后，實驗組與空白對照組，陰性對照組比較，卵巢癌細(xì)胞活力下降，差異有顯著性。
　　結(jié)論:
　　1、shRNA靶向沉默HDAC2基因，下調(diào)HDAC2的表達(dá)導(dǎo)致乙酰化p53k320及p53蛋白的表達(dá)上調(diào)；
　　2、下調(diào)HDAC2的表達(dá)可能通過上