右美沙芬、萊菔硫烷及二者聯(lián)合應(yīng)用對甲基汞致大鼠神經(jīng)毒性的保護作用.pdf

1、目的：
　　本研究通過整體動物實驗與體外細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合的方法，建立了MeHg短期重復(fù)暴露動物模型，研究MeHg致大鼠大腦皮質(zhì)興奮性毒性和氧化損傷，以及DM和SFN的保護作用;建立了神經(jīng)元染毒模型，研究MeHg致神經(jīng)元興奮性毒性和氧化損傷，以及DM、SFN和二者聯(lián)合的保護作用，觀察聯(lián)合用藥對MeHg致神經(jīng)元損傷是否具有協(xié)同保護作用。
　　方法：
　　一、DM預(yù)處理對MeHg致大鼠大腦皮質(zhì)興奮性毒性和氧化損傷的保護作用

2、r>　　實驗動物為健康成年SPF級Wistar大鼠72只，體重180±10 g，雌雄各半，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。按體重隨機分成4組，每組18只。分別為正常對照組、低劑量MeHg組、高劑量MeHg組和DM預(yù)處理組。每周一、三、五上午8:00進行干預(yù)（皮下）:對照組和低、高劑量MeHg組注射0.9％NaCl，DM預(yù)處理組注射13.5μmol/kg的DM。周一至周五上午10:00進行染毒（腹腔）:對照組注射0.9％NaCl，低劑量M

3、eHg組注射4μmol/kg的MeHgCl，高劑量MeHg組和DM預(yù)處理組注射12μmol/kg的MeHgCl。注射容量為5ml/kg，連續(xù)干預(yù)與染毒4周，染毒結(jié)束后24 h將大鼠麻醉，斷頭冰浴下分離腦皮質(zhì)。
　　每組取6只大鼠，采用冷原子吸收法測定大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)Hg含量。根據(jù)檢測指標(biāo)的不同，剩余大鼠大腦皮質(zhì)制成相應(yīng)濃度的組織勻漿液，采用比色法檢測大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)Glu、Gln、GSH、MDA、蛋白-SH和蛋白羰基的含量，及GS、P

4、AG、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、SOD和GSH-Px的活力。每組再取4只大鼠，制備單細(xì)胞懸液，測定大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量、Ca+的濃度及細(xì)胞凋亡率。每組再另取4只大鼠，提取總RNA及蛋白，應(yīng)用Real-time PCR及WesternBlotting法檢測NR1、NR2A、NR2B、GLAST、GLT-1、Nrf2、HO-1和γ-GCS的mRNA及蛋白表達。每組剩余4只大鼠左心室4％多聚甲醛灌流用于免疫組化法檢測

5、8-OHdG，HE染色及透射電鏡觀察。
　　二、SFN預(yù)處理對MeHg致大鼠大腦皮質(zhì)氧化損傷和興奮性毒性的保護作用
　　實驗動物為健康成年SPF級Wistar大鼠72只，體重180±10g，雌雄各半，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。按體重隨機分為4組，每組18只。分別為正常對照組、低劑量MeHg組、高劑量MeHg組、SFN預(yù)處理組。每周一、三、五上午8:00進行干預(yù)（皮下）:對照組和低、高劑量MeHg組注射0.9％NaCl，

6、SFN預(yù)處理組注射5.6μmol/kg的SFN。周一至周五上午10:00進行染毒（腹腔）:對照組注射0.9％NaCl，低劑量MeHg組注射4μmol/kg的MeHgCl，高劑量MeHg組和SFN預(yù)處理組注射12μmol/kg的MeHgCl。注射容量為5ml/kg，連續(xù)干預(yù)與染毒4周，染毒結(jié)束后24 h將大鼠麻醉，斷頭冰浴下分離腦皮質(zhì)。
　　每組取6只大鼠，采用冷原子吸收法測定大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)Hg含量。根據(jù)檢測指標(biāo)的不同，剩余大鼠大腦

7、皮質(zhì)制成相應(yīng)濃度的組織勻漿液，采用比色法檢測大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)GSH、MDA、蛋白-SH、蛋白羰基、Glu和Gln的含量，及SOD、GSH-Px、GS、PAG、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力。每組再取4只大鼠，制備單細(xì)胞懸液，測定大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量、Ca2+的濃度及細(xì)胞凋亡率。每組再另取4只大鼠，提取總RNA及蛋白，應(yīng)用Real-time PCR及Western Blotting法檢測Nrf2、HO-1、γ-GC

8、S、NR1、NR2A、NR2B、GLAST和GLT-1的mRNA及蛋白表達。每組剩余4只大鼠左心室4％多聚甲醛灌流用于免疫組化法檢測8-OHdG，HE染色及透射電鏡觀察。
　　三、DM、SFN及二者聯(lián)合預(yù)處理對MeHg致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元興奮性毒性和氧化損傷的保護作用
　　原代神經(jīng)元培養(yǎng)，NSE免疫熒光染色進行鑒定，陽性率達90％以上進行實驗。通過MTS法，觀察MeHg（0-2μM）處理0.5-12 h后觀察細(xì)胞毒性的變化，

9、以及DM(12.5-100μM)和SFN（0.125-1μM）預(yù)處理1-12h后的保護作用，確定MeHg染毒和DM、SFN與二者聯(lián)合預(yù)處理的劑量與時間，應(yīng)用酶標(biāo)儀對神經(jīng)元進行LDH漏出分析，并應(yīng)用上述方法檢測游離Ca+、ROS、細(xì)胞凋亡率、GSH和MDA的含量及Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力，并測定NR1、NR2A、NR2B、Nrf2、HO-1和γ-GCS mRNA和蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　一、DM預(yù)處

10、理對MeHg致大鼠大腦皮質(zhì)興奮性毒性和氧化損傷的保護作用
　　與正常對照組比較，隨著染汞劑量的增加，大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)的Hg含量逐漸增加，Glu的含量和PAG的活力呈上升趨勢，Gln的含量和GS的活力呈下降趨勢，NR1、NR2A、NR2B、GLAST和GLT-1的mRNA和蛋白均呈下降趨勢，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+和凋亡率是逐漸增加的，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力也是逐漸下降;同時，GSH和蛋白-SH的含量及SOD和GS

11、H-Px的活力是呈下降趨勢，MDA、8-OHdG和蛋白羰基的含量呈上升趨勢，Nrf2、HO-1和γ-GCS的mRNA和蛋白表達逐漸上升，大腦皮質(zhì)組織細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)病變損傷加重。與高劑量MeHg組比較，DM預(yù)處理后，上述指標(biāo)均有不同程度的改變，而大鼠大腦皮質(zhì)Hg含量未見顯著改變。
　　二、SFN預(yù)處理對MeHg致大鼠大腦皮質(zhì)氧化損傷和興奮性毒性的保護作用
　　與正常對照組比較，隨著染汞劑量的增加，大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)的Hg含量逐

12、漸增加，GSH和蛋白-SH的含量及SOD和GSH-Px的活力是呈下降趨勢，MDA、8-OHdG和蛋白羰基的含量呈上升趨勢，Nrf2、HO-1和γ-GCS的mRNA和蛋白表達逐漸上升;Glu的含量和PAG的活力呈上升趨勢，Gln的含量和GS的活力呈下降趨勢，NR1、NR2A、NR2B、GLAST和GLT-1的mRNA和蛋白均呈下降趨勢，細(xì)胞內(nèi)游離Ca+和凋亡率是逐漸增加的，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力也是逐漸下降，且大

13、腦皮質(zhì)組織細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)病變損傷加重。與高劑量MeHg組比較，SFN預(yù)處理后，上述指標(biāo)均有不同程度的改變，但大腦皮質(zhì)Hg含量未見顯著改變。
　　三、DM、SFN及二者聯(lián)合預(yù)處理對MeHg致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元興奮性毒性和氧化損傷的保護作用
　　通過MTS法觀察MeHg對神經(jīng)元可產(chǎn)生細(xì)胞毒性，而DM、SFN及二者聯(lián)合對神經(jīng)元具有保護作用。與對照組比較，隨著MeHg劑量和時間的增加，MeHg對神經(jīng)元的毒性呈現(xiàn)出劑量與時間效應(yīng)關(guān)

14、系，而與MeHg組比較，DM和SFN對神經(jīng)元的保護作用同樣存在劑量與時間效應(yīng)關(guān)系。隨后，根據(jù)MTS法結(jié)果分析，分為8個實驗組:對照組、MeHg組、50μM DM預(yù)處理組、0.5μM SFN預(yù)處理組、50μM DM+0.5μM SFN預(yù)處理組、25μM DM預(yù)處理組、0.25μM SFN預(yù)處理組和25μM DM+0.25μM SFN預(yù)處理組，干預(yù)與染毒時間均是6h。與對照組比較，MeHg組神經(jīng)元出現(xiàn)嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)損傷，LDH漏出率和細(xì)胞凋亡

15、率顯著上升;細(xì)胞內(nèi)Ca+水平顯著上升，而Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力明顯下降，NMDAR的mRNA和蛋白表達水平也顯著下降;ROS水平顯著上升，GSH的含量顯著下降而MDA的含量顯著上升，Nrf2、HO-1和γ-GCS的mRNA和蛋白表達顯著升高。與MeHg組比較，在50μMDM預(yù)處理組、0.5μMSEN預(yù)處理組和50μM DM+0.5μM SFN預(yù)處理組中以上指標(biāo)具有不同程度的改變，但這三組之間未見顯著性差異;在2

16、5μM DM預(yù)處理組、0.25μM SFN預(yù)處理組和25μM DM+0.25μM SFN預(yù)處理組中以上指標(biāo)亦出現(xiàn)不同程度的改變，但與25μM DM+0.25μM SFN預(yù)處理組相比，其余兩組中以上指標(biāo)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05，p＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.MeHg可以導(dǎo)致大鼠大腦皮質(zhì)產(chǎn)生興奮性毒性和氧化損傷，二者是相互影響。
　　2.低親和力、非競爭性NMDAR拮抗劑的DM和Nrf2/ARE通路有效地激活