對比研究狂犬病病毒BD06及SRV9株對宿主細(xì)胞干擾素通路的影響.pdf

1、狂犬病至今依然是一種嚴(yán)重的公共健康威脅，尤其是在發(fā)展中國家和地區(qū)。我國每年因狂犬病死亡的人數(shù)超過2000，然而狂犬病的發(fā)病機(jī)制至今依然不清楚，也缺乏有效的治療手段，使得其病死率接近100％?？袢〉牟≡饕强袢〔《荆≧ABV），RABV病毒粒子由5種結(jié)構(gòu)蛋白（核蛋白、磷蛋白、基質(zhì)蛋白、糖蛋白和大蛋白）及負(fù)鏈基因組RNA組成。為了弄清RABV的致病機(jī)制，近年來學(xué)者們一直致力于研究RABV病毒粒子各組分與宿主各種生物學(xué)過程之間的相互作用

2、，如RABV結(jié)構(gòu)蛋白對宿主固有免疫的影響等，希望能借類似的研究找到治療狂犬病的手段。可喜的是，最近對RABV的研究取得了很大的進(jìn)展，比如科學(xué)家發(fā)現(xiàn)RABV磷蛋白可以抑制宿主的干擾素通路，通過改變磷蛋白的這種能力可以影響病毒的毒力;又比如日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)RABV核蛋白也可以影響干擾素的激活，通過改變核蛋白的氨基酸組成可以減弱病毒的毒力。然而，依然有很多問題需要我們?nèi)ソ鉀Q，例如RABV的干擾素抑制能力與病毒毒力是否存在某種必然聯(lián)系;RABV磷

3、蛋白及核蛋白均可以影響干擾素的激活，那么其它蛋白是否也具有這種能力;RABV對干擾素的抑制能力在病毒感染過程中扮演一個(gè)什么角色，這些問題都還不清楚。鑒于此，我們設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)開展了本課題。
　　我們選擇了一株在世界范圍內(nèi)大規(guī)模應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)的RABV弱毒株SRV9和一株在中國廣泛流行的強(qiáng)毒株BD06，利用對比研究的方法分析了它們在體內(nèi)以及體外感染造成的基因表達(dá)差異，同時(shí)分析了兩株病毒結(jié)構(gòu)蛋白的干擾素拮抗能力，以弄清兩株病毒結(jié)構(gòu)蛋白干擾素

4、拮抗能力與病毒毒力之間的關(guān)系。
　　具體研究過程如下：
　　我們首先篩選條件獲取了在細(xì)胞上培養(yǎng)的較高滴度的BD06，并對其進(jìn)行了鑒定，確定沒有發(fā)生關(guān)鍵性突變，且毒力沒有減弱:然后我們利用腦內(nèi)攻毒的方法，將相同毒量104ffu(30μl)的強(qiáng)毒BD06和弱毒SRV9以及培養(yǎng)基對照接種Balb/c小鼠，觀察兩株病毒感染的過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRV9完全不致病，只是在感染的初期造成了感染病毒小鼠體重的下降，而感染BD06的小鼠在第5天全

5、部發(fā)病，并在第6天到第7天全部死亡;鑒于兩種病毒完全不一致的感染結(jié)果，而小鼠大腦對病毒的抵抗尤其是早期主要依賴于固有免疫，對RABV來說，宿主的固有免疫主要以干擾素相關(guān)反應(yīng)為核心，因此我們分析了小鼠感染兩株RABV的干擾素反應(yīng)。分別將感染兩株病毒后第2天、第4天和第6天的小鼠取腦組織提取RNA，利用定量PCR的方法分析了干擾素β(IFNβ)及其誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)相關(guān)蛋白OAS-1G和Mx1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRV9在感染后第2天即可激活較高

6、水平的干擾素反應(yīng)，并在第4天達(dá)到峰值，而在第6天出現(xiàn)明顯的回落;但是BD06感染的小鼠在第2天表現(xiàn)出一個(gè)相對較弱的干擾素反應(yīng)，在第4天明顯升高，而在第6天小鼠發(fā)病瀕死時(shí)仍持續(xù)升高。二者的干擾素反應(yīng)動力學(xué)差別很大，BD06感染誘導(dǎo)的干擾素反應(yīng)早期較弱而晚期較強(qiáng)與SRV9構(gòu)成顯著差別。
　　我們接下來對比了兩株RABV感染293細(xì)胞后，細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化。利用Ion proton平臺對RABV感染的293AD細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序。每個(gè)

7、樣品共獲得了約1200萬個(gè)reads，比對到參考基因和參考基因組之后，都能夠獲得大于80％的比對率，說明測序結(jié)果可靠。對所有讀數(shù)比對到參考基因后利用RPKM對基因的表達(dá)進(jìn)行了歸一化，并對BD06和SRV9相對于對照以及BD06相對于SRV9的基因表達(dá)變化進(jìn)行了定量分析，分別找到了2317（SRV9相對于對照），3331（BD06相對于對照）和2760（BD06相對于SRV9）個(gè)差異表達(dá)的基因。對這些差異表達(dá)的基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)根據(jù)G

8、O分類進(jìn)行的聚類中，SRV9及BD06相對于對照發(fā)生改變的基因并沒有明顯的底層條目聚集，而當(dāng)我們將BD06對SRV9的表達(dá)差異進(jìn)行聚類分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因在細(xì)胞因子這一條目聚集。對差異表達(dá)的基因基于KEGG注釋做了通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BD06造成的表達(dá)差異向病毒感染相關(guān)通路聚集，而SRV9的感染的差異基因富集不明顯。說明在感染的早期，BD06與細(xì)胞的相互作用相對于SRV9更加激烈。
　　考慮到RABV結(jié)構(gòu)蛋白對固有免疫有拮抗作

9、用，我們接著分別對比了BD06及SRV9對干擾素通路抑制能力的差別。利用RIG-Ⅰ蛋白N端的CARDs結(jié)構(gòu)域可以激活類似于RABV激活的固有免疫反應(yīng)，所以為了排除非相關(guān)成分對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，我們沒有選擇用RABV或者諸如VSV之類的病毒來激活細(xì)胞的固有免疫，而是選擇直接轉(zhuǎn)染表達(dá)人RIG-Ⅰ-CARDs的真核載體以激活細(xì)胞的固有免疫，主要是RIG-Ⅰ依賴的IFNβ相關(guān)通路。然后我們分別轉(zhuǎn)染表達(dá)載體對照及SRV9或BD06核蛋白、磷蛋白、基

10、質(zhì)蛋白或糖蛋白的真核質(zhì)粒，在細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)RIG-Ⅰ-CARDs以及RABV結(jié)構(gòu)蛋白，用免疫印跡檢測這些基因在細(xì)胞中的過表達(dá)后，用定量PCR的方法檢測細(xì)胞的干擾素反應(yīng)，包括檢測IFN3以及IFNβ誘導(dǎo)基因PKR和OAS的表達(dá)水平以對比分析RABV結(jié)構(gòu)蛋白對干擾素激活的抑制能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RABV磷蛋白表現(xiàn)出主要的對IFNβ激活的抑制能力，且磷蛋白的對干擾素通路的抑制能力要在SRV9和BD06之間存在顯著差異。盡管有報(bào)道表明RABV核蛋白對

11、干擾素通路激活也存在抑制能力，但是我們表達(dá)核蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)核蛋白對RIG-Ⅰ激活的抑制作用不顯著。另外盡管與RABV類似的彈狀病毒VSV基質(zhì)蛋白對干擾素激活有抑制能力，但是RABV的基質(zhì)蛋白并沒有表現(xiàn)出這種能力，同時(shí)糖蛋白也不能拮抗干擾素的激活過程。
　　由以上研究，可以得出結(jié)論如下：
　　狂犬病病毒弱毒SRV9株能在感染小鼠大腦后迅速誘導(dǎo)固有免疫反應(yīng)，并在感染中期達(dá)到峰值，但是會在感染后期回落;而強(qiáng)毒株BD06株則在感染早期

12、產(chǎn)生相對較弱的干擾素反應(yīng)，但是會隨著感染持續(xù)加強(qiáng)。兩株病毒的干擾素反應(yīng)動力學(xué)存在顯著差異，且單純的干擾素反應(yīng)并不足以清除病毒，保護(hù)動物免受死亡。
　　狂犬病病毒弱毒株SRV9株誘導(dǎo)細(xì)胞基因表達(dá)的變化是普遍的，但是富集程度不高，BD06相對于SRV9發(fā)生的基因表達(dá)變化在功能上向細(xì)胞因子這一分類富集，在通路上向抗病毒反應(yīng)相關(guān)通路富集。BD06在感染誘導(dǎo)更明顯的固有免疫反應(yīng)。
　　狂犬病病毒磷蛋白表現(xiàn)出主要的干擾素拮抗活性，核蛋白