gp10基因的原核表達(dá)及其聯(lián)用異煙肼的體外抗結(jié)核菌活性.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建分枝桿菌噬菌體D29 gp10基因重組質(zhì)粒，在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)重組蛋白gp10，檢測其單用及聯(lián)用異煙肼的體外抗結(jié)核菌活性，為開發(fā)結(jié)核病新藥提供新的方向。
　　方法：
　　1.以分枝桿菌噬菌體D29基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增gp10基因，克隆至原核表達(dá)載體 pET32a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET32a(+)-gp10，經(jīng)雙酶切和測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21

2、(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白gp10。經(jīng)SDS-PAGE鑒定后，采用鎳柱純化及透析復(fù)性目的蛋白。
　　2.利用2倍微量稀釋法原理，刃天青顯色法檢測重組蛋白gp10對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv和臨床分離耐多藥株的最低抑菌濃度。利用7×7微量棋盤稀釋法的原理，刃天青顯色法觀察重組蛋白gp10與異煙肼聯(lián)用針對H37Rv的部分抑菌濃度指數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.gp10基因經(jīng) PCR擴(kuò)增獲得長1479bp的條帶，重組質(zhì)粒p

3、ET32a(+)-gp10經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切獲得長約5900和1479 bp的條帶，測序結(jié)果與GenBank中查找的gp10基因序列完全一致，并表達(dá)相對分子質(zhì)量75.2 KDa的融合蛋白。
　　2.重組蛋白gp10對結(jié)核分枝桿菌 H37Rv和臨床分離耐多藥株的最低抑菌濃度為256μg/ml，與異煙肼聯(lián)用對結(jié)核分枝桿菌H37Rv部分抑菌濃度指數(shù)為0.5。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+