gp10基因的原核表達及其聯(lián)用異煙肼的體外抗結核菌活性.pdf

1、目的：
　　構建分枝桿菌噬菌體D29 gp10基因重組質粒，在E.coliBL21(DE3)中表達重組蛋白gp10，檢測其單用及聯(lián)用異煙肼的體外抗結核菌活性，為開發(fā)結核病新藥提供新的方向。
　　方法：
　　1.以分枝桿菌噬菌體D29基因組DNA為模板，PCR擴增gp10基因，克隆至原核表達載體 pET32a(+)，構建重組質粒 pET32a(+)-gp10，經(jīng)雙酶切和測序鑒定正確的重組質粒轉化至 E.coli BL21

2、(DE3)中誘導表達重組蛋白gp10。經(jīng)SDS-PAGE鑒定后，采用鎳柱純化及透析復性目的蛋白。
　　2.利用2倍微量稀釋法原理，刃天青顯色法檢測重組蛋白gp10對結核分枝桿菌標準株 H37Rv和臨床分離耐多藥株的最低抑菌濃度。利用7×7微量棋盤稀釋法的原理，刃天青顯色法觀察重組蛋白gp10與異煙肼聯(lián)用針對H37Rv的部分抑菌濃度指數(shù)。
　　結果：
　　1.gp10基因經(jīng) PCR擴增獲得長1479bp的條帶，重組質粒p

3、ET32a(+)-gp10經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切獲得長約5900和1479 bp的條帶，測序結果與GenBank中查找的gp10基因序列完全一致，并表達相對分子質量75.2 KDa的融合蛋白。
　　2.重組蛋白gp10對結核分枝桿菌 H37Rv和臨床分離耐多藥株的最低抑菌濃度為256μg/ml，與異煙肼聯(lián)用對結核分枝桿菌H37Rv部分抑菌濃度指數(shù)為0.5。
　　結論：
　　1.成功構建原核表達質粒pET32a(+