Gal抗原檢測(cè)方法研究與Gal抗原陽(yáng)性參考品標(biāo)定.pdf

1、目的：
　　來(lái)源于豬、牛、馬等動(dòng)物源性生物材料已被廣泛用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。如:生物心臟瓣膜、硬腦膜補(bǔ)片、生物敷料、止血防粘連材料等。然而，當(dāng)動(dòng)物組織或動(dòng)物源性生物材料中殘留的異種抗原進(jìn)入人體內(nèi)時(shí)，會(huì)引發(fā)超急性或慢性的免疫排斥反應(yīng)。這種免疫排斥反應(yīng)的主要靶抗原被認(rèn)為是由存在于動(dòng)物組織中的Galα1-3Galβ1-4GlcNAc結(jié)構(gòu)（簡(jiǎn)稱α-Gal抗原）引起的。Gal抗原存在于除了人和高等靈長(zhǎng)動(dòng)物以外的大部分哺乳動(dòng)物體內(nèi)。因此，檢測(cè)Ga

2、l抗原含量可以評(píng)價(jià)動(dòng)物組織或動(dòng)物源性生物材料的潛在免疫毒性。然而，目前尚無(wú)規(guī)范的檢測(cè)Gal抗原的方法。本研究利用特異性抗體M86，建立了檢測(cè)動(dòng)物組織或動(dòng)物源性生物材料中α-Gal抗原含量的酶聯(lián)免疫抑制法（ELISA抑制法）。
　　方法：
　　ELISA抑制法以兔血紅細(xì)胞作為參考品，以人工合成的Galα1，3-Gal-BSA為固相抗原，包被96孔板;同時(shí)，利用特異性抗-Gal單抗M86與兔血紅細(xì)胞和待檢動(dòng)物組織或動(dòng)物源性生物材

3、料表面的Gal抗原表位反應(yīng)后，再與固相抗原反應(yīng)，檢測(cè)剩余M86抗體，建立細(xì)胞或組織上的Gal抗原含量與M86結(jié)合抑制關(guān)系曲線;通過(guò)計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的50％結(jié)合抑制濃度，對(duì)比參考品的Gal抗原數(shù)來(lái)計(jì)算出待測(cè)物中的Gal抗原數(shù)。
　　為建立兔血紅細(xì)胞為參考品的M86 ELISA抑制法，對(duì)兔血紅細(xì)胞的Gal抗原數(shù)進(jìn)行科學(xué)定值很重要。既往文獻(xiàn)對(duì)兔血紅細(xì)胞Gal抗原數(shù)的賦值方法缺乏溯源性和科學(xué)性，所以本研究利用人工合成的Gal抗原（Galα1，

4、3-Gal-BSA，已知抗原表位數(shù)），根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)原理對(duì)每個(gè)兔血紅細(xì)胞的抗原數(shù)進(jìn)行科學(xué)定值。根據(jù)定值結(jié)果可計(jì)算出人工合成的Gal抗原在50％結(jié)合抑制時(shí)所對(duì)應(yīng)的Gal抗原數(shù)（為3.35×1012個(gè)）;對(duì)比這個(gè)抗原數(shù)最終確定了每個(gè)兔血紅細(xì)胞中Gal抗原數(shù)（約為2.73×107個(gè)）。
　　為驗(yàn)證試驗(yàn)方法的靈敏性和特異性，本研究研制了Gal抗原陽(yáng)性和陰性參考品，利用上述建立的方法為陽(yáng)性參考品進(jìn)行賦值標(biāo)定，并進(jìn)行穩(wěn)定性和均勻性考察。同時(shí)證實(shí)

5、了陰性參考品不會(huì)檢測(cè)到Gal抗原。本研究完成的Gal抗原陽(yáng)性和陰性參考品的標(biāo)定結(jié)果將作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的報(bào)批資料之一。在本研究建立的以兔血紅細(xì)胞為參考品，定量檢測(cè)Gal抗原的M86 ELISA抑制法中將同時(shí)使用Gal抗原陽(yáng)性和陰性參考品作為對(duì)照組，既保證了該方法具有可溯源性，又能夠驗(yàn)證每次試驗(yàn)的靈敏性和特異性，以判斷試驗(yàn)的有效性（是否可接受）。
　　結(jié)果：
　　利用本研究建立的方法考察了大鼠主要臟器組織中α-Gal抗原表達(dá)情況。其

6、結(jié)果是，單位質(zhì)量動(dòng)物組織（濕重）所含有的α-Gal抗原數(shù)分別為:肝臟組織5.46×1013個(gè)/mg;心臟組織5.69×1012個(gè)/mg;脾臟組織1.14×1014個(gè)/mg;肺臟組織，2.12×1014個(gè)/mg;腎臟組織8.52×1014個(gè)/mg。同時(shí)，考察了豬真皮生物材料脫細(xì)胞制備工藝前后的Gal殘留量，其檢測(cè)結(jié)果為:脫細(xì)胞處理前為1.35×1013個(gè)/mg，脫細(xì)胞處理后Gal含量為5.17×1012個(gè)/mg，減少了60％左右。