下調(diào)Dicer1基因激活自噬促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株C13K對順鉑耐藥的研究.pdf

1、目的:
　　核糖核酸酶Ⅲ核酸內(nèi)切酶Dicer1是MicroRNA合成的關(guān)鍵酶之一，主要位于細(xì)胞胞質(zhì)中。在卵巢腫瘤的研究中，卵巢癌患者伴有Dicer1基因的異常調(diào)節(jié)往往提示預(yù)后不良。但是至今有關(guān)Dicer1基因如何影響卵巢癌的生物學(xué)特性和化療耐藥的研究并不是很清楚。因此本實驗的研究主要目的是在卵巢癌細(xì)胞株C13K中，下調(diào)Dicer1基因可以誘導(dǎo)自噬參與卵巢癌的化療耐藥的探索。
　　方法:
　　本實驗主要的實驗方法是：(1

2、)運(yùn)用細(xì)胞增殖與毒性實驗（CCK8）來檢測下調(diào)Dicer1基因后卵巢癌細(xì)胞株C13K順鉑的敏感性及半數(shù)抑制濃度（IC50）。(2)利用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)進(jìn)行下調(diào)卵巢癌細(xì)胞株C13K中的Dicer1基的表達(dá)量和下調(diào)Dicer1基因后對順鉑的敏感性以及加入抑制自噬的藥物（3-MA）后是否逆轉(zhuǎn)這種耐藥效應(yīng)，其次通過蛋白質(zhì)印記（western blot）觀察Dicer1和自噬相關(guān)的關(guān)鍵基因（ATG5，LC3B）在下調(diào)Dicer1基因

3、后卵巢癌細(xì)胞株C13K的表達(dá)量以及下調(diào)Dicer1基因并且順鉑處理后凋亡蛋白（Caspase3,c-PARP）的表達(dá)量。（3）通過透射電子顯微鏡及共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)，來觀察Dicer1基因下調(diào)以及順鉑處理后卵巢癌細(xì)胞的自噬體的變化。（4）通過流式細(xì)胞學(xué)實驗技術(shù)，來觀察Dicer1-si,ATG5-si以及順鉑處理后細(xì)胞凋亡的情況。（5）通過運(yùn)用公共數(shù)據(jù)庫TCGA，我們研究了Dicer1基因和ATG5基因在卵巢癌病人中的表達(dá)與預(yù)后的

4、關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)及現(xiàn)象，可以得到如下結(jié)果：（1）通過CCK8發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞株C13K在Dicer1基因下調(diào)后對化療藥物順鉑的耐藥性增加。（2）通過siRNA干擾和western blot發(fā)現(xiàn)下調(diào)Dicer1基因在卵巢癌細(xì)胞株(C13K)的表達(dá)后，凋亡蛋白（Caspase3,c-PARP）表達(dá)也降低且加入自噬抑制劑（3MA）可以逆轉(zhuǎn)這種耐藥效應(yīng)。（3）通過透射電子顯微鏡和熒光共聚焦激光掃描顯微鏡發(fā)現(xiàn)Di

5、cer1下調(diào)后以及順鉑處理后，自噬現(xiàn)象比較明顯。(4)在TCGA數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)Dicer1基因表達(dá)量低的患者預(yù)后較差，自噬基因（ATG5）表達(dá)量高的患者預(yù)后不良。（5）我們把自噬形成的關(guān)鍵基因（ATG5）沉默以及使用藥物抑制自噬生成后，發(fā)現(xiàn)C13K對順鉑的敏感性增加。
　　結(jié)論:
　　通過以上實驗數(shù)據(jù)的結(jié)果分析，我們可以得出一個這樣的結(jié)論即在卵巢癌細(xì)胞株C13K中，Dicer1下調(diào)可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對化療藥