hsBAFF抑制自噬促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活分子機(jī)理研究.pdf

1、本文運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、熒光染色、RNA干擾、MTS分析、Western blotting等細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)，以B淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究了hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活與自噬的關(guān)系，深入探討了hsBAFF通過Ca2+/CaMKⅡ-Akt/mTOR信號(hào)通路影響自噬在促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活中的作用及其分子機(jī)理。具體結(jié)果如下:
　　1 hsBAFF抑制自噬促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活
　　Raji細(xì)胞、或用shRNALC3Ⅰ

2、/Ⅱ、shRNA GFP或Ad-GFP-LC3感染的Raji細(xì)胞，采用不同濃度hsBAFF（0、0.5、1、1.5、2.5、5μg/ml）刺激12h、或以2.5μg/mlhsBAFF刺激不同時(shí)間(0、4、8、12、24、48 h)、或通過hsBAFF(0、1、2.5μg/ml)刺激12、24和/或48h。之后，分析MDC熒光染色和GFP-LC3染色的細(xì)胞自噬體表現(xiàn)、MTS分析和細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖與存活表現(xiàn)，Westernblottin

3、g檢測(cè)LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、Beclin1等蛋白分子表達(dá)。結(jié)果顯示:hsBAFF以濃度和時(shí)間依賴的方式抑制B細(xì)胞自噬表現(xiàn)、引發(fā)LC3Ⅱ表達(dá)下調(diào)與hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活對(duì)應(yīng);下調(diào)LC3Ⅰ/Ⅱ顯示hsBAFF促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活被降低。提示:hsBAFF抑制自噬促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活。
　　2 hsBAFF通過激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路抑制自噬促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活Raji細(xì)胞、用Ad-GFP或Ad-dn-Akt感染的Raji

4、細(xì)胞、或用shRNA LC3Ⅰ/Ⅱ、shRNA mTOR或shRNA GFP感染的Raji細(xì)胞，分別用雷帕霉素(100 ng/ml)、PP242（1μM）預(yù)處理2h、或Akt抑制劑X(20μM)、CQ（5μM）預(yù)處理1h后加入2.5μg/ml hsBAFF刺激12h或48 h。之后，MTS和細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖與存活表現(xiàn)，Western blotting檢測(cè)LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、Beclin1、S6K1、Akt等蛋白分子的表達(dá)。結(jié)果顯示

5、:Akt抑制劑X、雷帕霉素或PP242降低p62并增加LC3Ⅱ的表達(dá)，同時(shí)阻止hsBAFF誘導(dǎo)Akt、S6K1磷酸化;下調(diào)LC3Ⅰ/Ⅱ強(qiáng)化Akt抑制劑X或雷帕霉素抑制hsBAFF促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活;鈍化Akt活性增強(qiáng)雷帕霉素或PP242阻滯hsBAFF抑制自噬促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活;沉默mTOR也提高Akt抑制劑X或PP242阻滯hsBAFF抑制自噬促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活。提示:hsBAFF通過激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路抑制自噬促進(jìn)B細(xì)

6、胞增殖和存活。
　　3 hsBAFF通過Ca2+-CaMKⅡ激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路抑制自噬促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活
　　Raji細(xì)胞、或用shRNA GFP或shRNA CaMKⅡ感染的Raji細(xì)胞，分別用PP242(1μM)預(yù)處理2h,BAPTA/AM(20μM)、EGTA(100μM)、2-APB(100μM)、 KN93(10μM)預(yù)處理1h后加入2.5μg/ml hsBAFF刺激12h或48h。之后，MTS和細(xì)胞計(jì)

7、數(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖與存活表現(xiàn)，Western blotting檢測(cè)LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、Beclin1、Akt、S6K1、CaMKⅡ等蛋白分子表達(dá)。結(jié)果顯示:BAPTA/AM螯合細(xì)胞內(nèi)Ca2+以及EGTA、2-APB減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加LC3Ⅱ表達(dá)，同時(shí)阻滯hsBAFF誘導(dǎo)Akt、S6K1磷酸化，而聯(lián)合PP242預(yù)處理這些變化更明顯，表明hsBAFF激活A(yù)kt/mTOR通路抑制自噬促進(jìn)B細(xì)胞增殖和存活是Ca2+依賴的;BAPTA/AM、E